腦心通對氧化低密度脂蛋白誘導血管平滑肌細胞增殖和自噬的影響

邱偉文，鄭麗云，鄔至平，蔡學禮，彭瀟，黃躍金，黃良通（麗水市中心醫(yī)院 神經內科，浙江 麗水 323000）

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腦心通對氧化低密度脂蛋白誘導血管平滑肌細胞增殖和自噬的影響

邱偉文，鄭麗云，鄔至平，蔡學禮，彭瀟，黃躍金，黃良通
（麗水市中心醫(yī)院 神經內科，浙江 麗水 323000）

［摘 要］目的：觀察腦心通對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達的影響，探討其抗動脈粥樣硬化（AS）的可能機制。方法：將人臍動脈VSMC分為：對照組、ox-LDL組、腦心通組、ox-LDL+腦心通組。采用噻唑藍（MTT）法和克隆形成實驗檢測細胞增殖作用，Western blot法檢測自噬相關蛋白Beclin1與LC3表達水平的改變。結果：ox-LDL顯著促進VSMC的增殖和克隆形成，而腦心通對VSMC的增殖和克隆形成無明顯作用，但其抑制ox-LDL對VSMC增殖和克隆形成的促進作用。Western blot結果顯示ox-LDL顯著增加VSMC自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達水平；腦心通抑制ox-LDL增加的Beclin1和LC3的表達。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3MA抑制ox-LDL對VSMC的增殖作用。結論：腦心通可能通過降低VSMC自噬抑制ox-LDL對VSMC的增殖作用。

［關鍵詞］腦心通；氧化低密度脂蛋白；細胞自噬；血管平滑肌細胞

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴重危害人類健康的常見病，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎。AS的發(fā)病機制存在多種學說，涉及多種危險因素，臨床尚缺乏有效的防治藥物。腦心通是一種中成藥，已廣泛應用于治療心腦血管疾病，具有抗AS、保護血管內皮細胞、穩(wěn)定AS易損斑塊、保護缺血再灌注損傷神經及抑制神經細胞凋亡的作用［1］。婁莉等［2］研究表明腦心通能明顯抑制氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖作用，然而腦心通的作用機制仍未明確。自噬是廣泛存在于真核細胞中的細胞生物學行為，是一種進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程，是細胞進行自我保護的一種重要機制，在維持細胞存活、更新、物質再利用和內環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用，并參與細胞的增殖、凋亡、遷移等過程［3］。本研究通過噻唑藍（MTT）法、克隆形成和Western blot方法檢測細胞自噬在腦心通抑制ox-LDL誘導VSMC增殖中的作用，探討腦心通抗AS的可能機制。

1　材料和方法

1.1材料 人臍動脈VSMC購買于上海生命科學細胞庫；腦心通由陜西步長制藥有限公司提供，國藥準字Z20025001；ox-LDL購買于北京協(xié)和生物科技有限公司；鼠源性抗體Tubulin購買于Sigma公司；Beclin1、LC3單克隆抗體購買于CST公司；MTT、3MA購買于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1人臍動脈VSMC培養(yǎng)：使用含體積分數(shù)10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)皿內接種細胞后置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期、增殖旺盛細胞進行連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖：將增殖的VSMC分為對照組、ox-LDL組、腦心通組、ox-LDL+腦心通組。取對數(shù)生長期的VSMC，調細胞密度為2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。細胞貼壁之后，棄去培養(yǎng)液，然后加入不同處理條件培養(yǎng)基，對照組不加藥，并設置調零孔，每組設置6個復孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃恒溫箱孵育4 h后，棄去上清液，加入DMSO 120 μL終止反應。 以調零孔光密度值（OD）調零校準，用酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm波長處測各孔的OD值。

1.2.3細胞克隆形成：取對數(shù)生長期各組細胞，胰蛋白酶消化后，臺盼藍作活細胞計數(shù)，調整細胞濃度，將調整后的細胞懸液接種于6孔板，每孔500個細胞。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)10 d，每隔3 d更換一次培養(yǎng)基。棄生長液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下計細胞集落數(shù)（集落標準：含有50個以上細胞的細胞團為一個細胞集落）并照相。

1.2.4Western blot法檢測信號通路改變：不同條件處理VSMC后，預冷PBS漂洗2次，隨后加入細胞裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清。BAC法進行蛋白定量，取20 μg總蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉至PVDF膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜，隨后PBST緩沖液洗膜3次，每次8 min，加入HRP標記的二抗室溫孵育1～2 h，PBST緩沖液再次洗膜3次，每次8 min，ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，ImageJ軟件分析，以Tubulin為內參，目標條帶與內參灰度值的比值反映相關蛋白的相對表達值。

1.3統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，各觀察值間的多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著性差異t（LSD-t）檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1腦心通抑制ox-LDL的促進VSMC增殖的作用

ox-LDL組中，0～60 mg/L ox-LDL呈劑量依賴性促進VSMC增殖，OD值分別為：0.77±0.05（0 mg/L）、0.97±0.01（20 mg/L）、1.09±0.05（40 mg/L）、1.31±0.11（60 mg/L）；腦心通組中，0.2～0.8 g/L腦心通對VSMC的活性無明顯抑制作用，腦心通（0～0.8 g/L）呈劑量依賴性抑制ox-LDL（40 mg/L）對VSMC增殖的促進作用，OD值分別為：0.85±0.11（0 g/L）、1.14±0.09（0.2 g/L）、1.06±0.07（0.4 g/L）、0.75±0.08（0.8 g/L），見圖1。各組細胞克隆形成率分別為：100%（對照組）、185.5%±3.1%（40 mg/L ox-LDL組）、102.4%±2.6%（0.8 g/L腦心通組）、105.4%±1.6%（40 mg/L ox-LDL+0.8 g/L腦心通組），與對照組相比，40 mg/L的ox-LDL克隆形成明顯增高（P＜0.01），0.8 g/L腦心通對VSMC的克隆形成無明顯作用，但與40 mg/L ox-LDL相比，0.8 g/L腦心通抑制ox-LDL促進VSMC的克隆形成（P＜0.05），見圖2。

2.2腦心通抑制ox-LDL誘導的VSMC自噬激活作用

Beclin1和LC3表達是細胞發(fā)生自噬的關鍵蛋白，反映細胞自噬強度。Western blot結果顯示，ox-LDL組與對照組比，不同劑量ox-LDL呈劑量依賴性增加VSMC自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達，而ox-LDL+腦心通組中，腦心通能夠明顯抑制ox-LDL誘導的細胞自噬相關蛋白Beclin1和LC3表達，見圖3。

2.3自噬抑制劑3MA抑制ox-LDL誘導的VSMC增殖

為進一步證明自噬的作用設立自噬抑制劑ox-LDL+ 3MA組，MTT法結果顯示，對照組、ox-LDL組、ox-LDL+ 3MA組的OD值分別為：0.95±0.11、1.32±0.10［與對照組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）］、0.85± 0.6［與對照組比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）］，3MA抑制ox-LDL誘導的VSMC增殖，見圖4。

3　討論

圖1　腦心通抑制ox-LDL的促VSMC增殖作用

ox-LDL是AS的重要危險因子，誘發(fā)血管內皮損傷，參與AS的發(fā)生與發(fā)展。腦心通是一種用于治療各種心腦血管疾病的中成藥，其治療效果已經得到廣泛認同。研究表明腦心通明顯抑制ox-LDL誘導的VSMC增殖作用，但其內在機制仍未完全明確。本研究探討腦心通調節(jié)細胞自噬抑制ox-LDL誘導的VSMC增殖作用。

圖2 各組細胞克隆形成圖

AS是血管壁內皮細胞、脂質、單核巨噬細胞、VSMC及血小板相互作用而導致的慢性炎性反應，是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康［4］。自噬是維持細胞存活、更新、物質再利用和內環(huán)境穩(wěn)定的重要活動過程［5］。自噬功能紊亂參與多種疾病的發(fā)生。目前自噬參與AS形成的觀點已得到廣泛認同。有研究［6］表明自噬在AS形成過程起重要保護作用，而且泡沫細胞自噬功能混亂導致血管炎癥發(fā)生，加速AS形成［7］。盡管自噬如何影響AS形成尚未完全明確，但多種調節(jié)細胞自噬功能的藥物已應用于預防和治療AS，如雷帕霉素、依維莫司、丹酚酸B、黃芩、射干苷等［8］。

腦心通作為一種中成藥物，由黃芪、水蛭、地龍、全蝎、當歸、川芎、丹參、紅花、赤芍、桂枝、牛膝等16種中藥制成，具有益氣活血、健脾化痰、化瘀通絡等功效，有抗AS、保護血管內皮細胞損傷、穩(wěn)定AS易損斑塊作用和保護缺血再灌注損傷神經及抑制神經細胞凋亡的作用［9］。席東焱［10］研究表明腦心通具有保護血管內皮細胞和改善血小板功能的作用；劉振權等［11］研究發(fā)現(xiàn)腦心通對大鼠腦微血管內皮細胞模擬腦缺血損傷有保護作用，其機制可能與抗脂質過氧化作用有關。目前腦心通對VSMC作用的研究較少，婁莉等［2］研究發(fā)現(xiàn)腦心通能明顯抑制ox-LDL誘導VSMC增殖作用。本研究結果顯示有效劑量的腦心通對VSMC無明顯毒性作用。ox-LDL明顯促進VSMC的增殖，腦心通抑制ox-LDL促進VSMC增殖作用，這與之前的文獻報告一致。

在細胞因子、炎性反應、趨化因子、生長因子及致病因素等作用下，VSMC發(fā)生細胞增殖和功能轉變［12］。ox-LDL是AS的重要危險因子，能夠促進VSMC增殖和功能轉變［13］。Li等［14］研究發(fā)現(xiàn)c-Ski抑制ox-LDL和血小板源性生長因子對VSMC自噬和增殖的促進作用。Ding等［15］研究發(fā)現(xiàn)低濃度（10～40 μg/mL）ox-LDL促進自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1與Atg5的表達和細胞增殖，而高濃度（60 μg/ mL）ox-LDL抑制自噬，促進VSMC凋亡。Grootaert等［16］研究發(fā)現(xiàn)Atg7敲除誘發(fā)的細胞自噬缺陷加速VSMC死亡，促進內膜和粥樣斑塊形成。因此，ox-LDL促進VSMC增殖可能與其促進細胞自噬激活有關。和LC3的表達增高，同時降低了ox-LDL誘導的VSMC增殖，這一作用與自噬抑制劑3MA對ox-LDL誘導的VSMC增殖相同。

圖3 ox-LDL和腦心通對Beclin1和LC3表達的影響

圖4　MTT法檢測VSMC增殖結果

綜上所述，腦心通降低VSMC自噬活性，抑制ox-LDL促進VSMC增殖和細胞自噬相關蛋白Beclin1和LC3表達，這一過程可能參與腦心通抗AS的作用。

參考文獻：

Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異性基因，與III型磷脂酰肌醇-3激酶形成復合物參與自噬體形成，是自噬形成和成熟的標志。LC3位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬形成，存在I型和II型2種分子。發(fā)生自噬時，細胞質內的LC3I型與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3II型，是自噬體的標示，用LC3II/LC3I比值表示細胞自噬強度。本研究結果顯示ox-LDL增高了VSMC中LC3和Beclin1的表達；而腦心通抑制ox-LDL誘導VSMC的Beclin1

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

The effects of naoxintong on vascular smooth muscle cells proliferation and autophagy induced by oxidized low-density lipoprotein

QIU Weiwen，ZHENG Liyun，WU Zhiping，CAI Xueli，PENG Xiao，HUANG Yuejin，HUANG Liangtong. Department of Neurology，Lishui Central Hospital，Lishui，323000

Abstract:Objective: To investigate the effects of naoxintong on the vascular smooth muscle cells （VSMC） proliferation and the expression of Beclin1 and LC3 induced by oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）. Methods: The VSMC were divided into four groups: control group，ox-LDL group，naoxintong group and ox-LDL+naoxintong group. MTT and colony formation assay was used to test the proliferation. Western blot was used to analysis the expression of Beclin1 and LC3. Results: ox-LDL significantly promoted the viability and colony formation of VSMC. Naoxintong had no effect on the proliferation and colony formation but inhibited the proliferation and colony formation of VSMC induced by ox-LDL. Western blot results demonstrated that ox-LDL significantly promoted the expression of Becli1 and LC3，naoxintong inhibited the expression of Beclin1 and LC3 induced by ox-LDL. Furthermore，MTT verified that autophagy inhibitors 3MA inhibited significantly the proliferation induced by ox-LDL. Conclusion: Naoxintong inhibited the VSMC proliferation induced by ox-LDL through inhibited the cell autophagy.

Key words:naoxintong； ox-LDL； autophagy； vascular smooth muscle cells

作者簡介：邱偉文（1966-），男，浙江麗水人，副主任醫(yī)師，碩士。

基金項目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2015KYB451）。

收稿日期：2016-01-07

［中圖分類號］R285；R743.1

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.006