腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響

杜培坤+李妍怡+王艷玲+金紅

【摘要】目的 探討腦心通對(duì)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察大鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，并做海馬區(qū)HE染色，觀察海馬組織的病理改變。結(jié)果 腦海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯降低。結(jié)論 腦心通可以減少腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而可以防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載損傷，保護(hù)腦組織及神經(jīng)細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】腦心通；缺血再灌注；Ca2+

【中圖分類號(hào)】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2016.04..03

急性缺血性腦血管病是危害人類健康的常見病和多發(fā)病之一，具有較高的致死率、致殘率及復(fù)發(fā)率，中醫(yī)藥對(duì)腦血管病的治療越來越受到關(guān)注，尤其中藥復(fù)方制劑可以通過多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)作用于腦缺血各環(huán)節(jié)，其中腦心通膠囊是由黃芪、丹參、桃仁、紅花、地龍等中藥組成的復(fù)方制劑，多項(xiàng)研究表明，腦心通膠囊治療氣虛血瘀、脈絡(luò)閉阻導(dǎo)致的中風(fēng)臨床療效確切，是臨床防治缺血性腦卒中的有效藥物[1]。為探討其治療急性缺血性腦血管病的部分作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)合鼠尾放血的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察大鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量變化及海馬組織的病理改變進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選用4月齡無特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠50只，步長(zhǎng)腦心通膠囊，細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)試劑，流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

選取SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組10只和假手術(shù)組10只，余30只造模。然后再采用卒中指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)選取20只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組10只、步長(zhǎng)腦心通組10只。

1.2.2 模型制備

采用由Nordtrom建立的2VO阻斷缺血模型，加鼠尾放血改良后用于本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽鋄3]。要求術(shù)前禁食水。用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，仰臥固定，被皮，常規(guī)消毒，沿頸正中皮膚切口，再用神經(jīng)剝離器分離頸部雙側(cè)迷走神經(jīng)，清晰暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾閉頸總動(dòng)脈，阻斷血流10 min，間隔10 min，再用無創(chuàng)動(dòng)脈夾閉頸總動(dòng)脈，阻斷血流10 min，然后恢復(fù)血流。阻斷的同時(shí)，剪鼠尾放血，造成全腦血流低灌注，最后熱凝止血，造成急性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。

假手術(shù)組：與造模組操作過程大致相同，但不阻斷頸總動(dòng)脈亦不放血。

1.3 評(píng)價(jià)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)

采用卒中指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]。卒中指數(shù)評(píng)分如下：毛發(fā)臟亂、全身顫抖各1分，運(yùn)動(dòng)減少或遲鈍1分，耳觸覺遲鈍為3分，眼固定狀睜開為3分，后肢外展呈八字為3分，上瞼下垂為1分，轉(zhuǎn)圈為3分，驚厥或爆發(fā)運(yùn)動(dòng)為3分，極度虛弱為6分。總分25分，>10分明顯有損傷。選取卒中指數(shù)>10分的動(dòng)物為造模成功的

動(dòng)物。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦組織海馬區(qū)Ca2+。用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以“x±s”表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠卒中指數(shù)評(píng)分的影響

大鼠的卒中指數(shù)評(píng)分步長(zhǎng)腦心通組比模型組低，且隨時(shí)間推移呈遞減趨勢(shì)。第1天，步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功，并且各用藥組動(dòng)物選取無差異；第6天，步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；第12天，步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明步長(zhǎng)腦心通能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為癥狀和體征，有較好療效，但中藥治療作用起效慢。

見表1。

2.2 腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的影響

腦缺血再灌注后，與空白組、假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦內(nèi)海馬組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯升高，說明模型組發(fā)生了明顯的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載作用；與模型組比較，腦心通組較模型組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明腦心通可有效緩解腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載作用。見表2。

2.3 腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織結(jié)構(gòu)的影響

腦心通可以減輕腦缺血再灌注引起的大鼠腦海馬組織損傷，減輕神經(jīng)細(xì)胞的水腫、變性、壞死等，保護(hù)及修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞。

①空白組及假手術(shù)組：海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，分布密集，排列規(guī)則。

②模型組：海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏、紊亂，丟失嚴(yán)重，胞漿內(nèi)嗜酸性染色增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮或細(xì)胞核形狀不規(guī)則，周圍間隙及血管間隙明顯

增寬。

③步長(zhǎng)腦心通組：海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞稍稀疏，呈圓形，橢圓形，或多角形，細(xì)胞排列較有序。

3 討 論

Ca2+廣泛分布于人體的細(xì)胞和體液之中，對(duì)細(xì)胞的代謝和功能有重要的調(diào)節(jié)作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，Ca2+被稱為神經(jīng)生理學(xué)家的“DNA”，它作為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的重要信使，參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多種酶學(xué)的轉(zhuǎn)運(yùn)等活動(dòng)[4]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)外鈣離子保持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)，Ca2+平衡遭到破壞，大量Ca2+內(nèi)流引起Ca2+超載。首先能量代謝障礙，ATP耗竭，使Na+內(nèi)流，K+外流，神經(jīng)細(xì)胞模去極化，電壓依賴性鈣通道開放，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增加，同時(shí)能量耗竭，鈣離子泵能量障礙，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+傳出能力下降，可使細(xì)胞Ca2+內(nèi)超載；但細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多主要是由敏感性、主動(dòng)性的受體門控通道來完成，這些通道特別是NMDA-R激活引起門控性通道的開放，在缺血缺氧狀態(tài)下由于谷氨酸的過多釋放以及攝取障礙而被激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，引起神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，可導(dǎo)致5-羥色胺及去甲腎上腺素釋放增多，引起腦血管痙攣，局部血流變狀況惡化，加重腦缺血；神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，大量Ca2+沉積于線粒體，與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合，形成不溶性磷酸鈣，造成氧化磷酸化電子傳遞脫耦聯(lián)，致使膜電位喪失引起跨膜離子流失效，神經(jīng)細(xì)胞呼吸功能受到抑制，導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)細(xì)胞損傷；神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，可致胞漿內(nèi)或溶酶體內(nèi)Ca2+依賴性酶類和磷脂酶類大量激活，使神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)分解，神經(jīng)細(xì)胞骨架破壞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[5]；神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，可激活磷脂酶A2和磷脂酶C，使膜磷脂降解，產(chǎn)生大量游離脂肪酸，特別是花生四烯酸，造成脂質(zhì)膜流動(dòng)性降低及通透性增高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞腫脹，以及花生四烯酸在環(huán)氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和血小板激活因子等活性物質(zhì)，并在氧自由基的作用下，啟動(dòng)膜脂質(zhì)過氧化，形成脂性自由基，破壞生物膜，并進(jìn)一步促進(jìn)受體通道興奮性氨基酸的釋放，造成興奮性氨基酸的毒性，加重神經(jīng)細(xì)胞損害[6] 。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：中藥復(fù)方制劑腦心通可以減輕腦缺血再灌注引起的大鼠腦海馬組織損傷，減輕神經(jīng)細(xì)胞的水腫、變性、壞死等，保護(hù)腦組織；還可以減少腦缺血再灌注后細(xì)胞外Ca2+通過電壓依賴性通道和受體門控性通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低腦缺血再灌注引起的大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量，從而可以防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載引起的一系列病理?yè)p傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

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本文編輯：徐 陌