骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠肝硬化模型的作用研究

牛艷君，李瑩，吳永娜，嚴(yán)祥

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000，1.老年病科；2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

?

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠肝硬化模型的作用研究

牛艷君1，李瑩2，吳永娜2，嚴(yán)祥1

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000，1.老年病科；2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

［摘 要］目的 探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的培養(yǎng)和其肝硬化模型的制備，以及兩者之間的相互作用。方法 首先，提取小鼠骨髓，移至培養(yǎng)瓶中，根據(jù)全骨髓貼壁法的原理培養(yǎng)干細(xì)胞；然后，采用CCl4為主的方法對(duì)小鼠進(jìn)行肝硬化模型的制備；最后，把培養(yǎng)成功的骨髓干細(xì)胞通過肝動(dòng)脈和尾靜脈途徑移植治療造模成功的肝硬化小鼠，觀察療效。結(jié)果 根據(jù)多種單克隆抗體的表達(dá)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，成功培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；對(duì)造模小鼠肝臟組織進(jìn)行病理切片，病理報(bào)告圖示典型的肝硬化，證明造模成功；通過肝動(dòng)脈和尾靜脈途徑移植治療肝硬化模型小鼠，最后報(bào)告干細(xì)胞治療的病理結(jié)果，肝硬化程度減輕，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的療效。結(jié)論 自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化是有效的，但仍需要基礎(chǔ)研究和大樣本的臨床數(shù)據(jù)。

［關(guān)鍵詞］骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝硬化模型；小鼠；移植

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制的特點(diǎn)，而且來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，自體移植不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥［1］。肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，病理組織學(xué)上有廣泛的肝細(xì)胞壞死、殘存肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性再生，結(jié)締組織增生與纖維隔形成，導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和假小葉形成，逐漸發(fā)展為肝硬化［2］。臨床上多采用內(nèi)科保守治療，但效果欠佳［3］。BMSCs是肝硬化時(shí)肝細(xì)胞的主要來源，可以修復(fù)、補(bǔ)充缺損的肝組織，達(dá)到改善肝臟功能的目的。BMSCs移植治療肝硬化是近年來研究的熱點(diǎn)，與肝移植相比，具有取材方便、無排斥反應(yīng)、安全性高及價(jià)格相對(duì)低廉等優(yōu)點(diǎn)，為肝硬化患者的治療提供了新的治療手段［4］。本實(shí)驗(yàn)擬建立小鼠肝硬化模型，通過不同途徑注射小鼠BMSCs，進(jìn)行基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/C小鼠，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)組為4只3日齡雄性乳鼠，肝硬化模型制備組為BALB/C雄性小鼠30只，體重為40～50 g，由甘肅省獸醫(yī)研究所動(dòng)物研究中心提供。

1.2主要試劑和儀器

F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）、血清（Gibco公司）、雙抗（青霉素及鏈霉素，Gibco公司）、0.25%的胰酶（含EDTA，Gibco公司）、PBS緩沖液、CD單克隆抗體（BD公司）、CCL4（蘭州化工廠）、苯巴比妥鈉（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院）、色拉油（金龍魚）、乙醇（北京二鍋頭）。Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱、LICA倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

1.3方法

1.3.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)方法進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)。用頸椎脫臼法處死小鼠，放入70%乙醇的燒杯中，使其體毛完全浸濕5 min，將大鼠放在超凈工作臺(tái)消毒托盤內(nèi)，用鑷子夾其腹中部皮膚，沿中間作一切口，剪開腹壁各層；將切口拉至股骨，小心分離股骨上的肌肉，從關(guān)節(jié)兩端剪斷股骨，放在盛有PBS液平皿中，再次去除肌肉并用PBS液沖洗3次；將股骨中間剪斷，用1 mL注射器吸取F12培養(yǎng)液（10%的血清、1%的雙抗）反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)液，吹打散細(xì)胞，接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2小鼠肝硬化模型的制備：小鼠先在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，不限食水。將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，正常對(duì)照組10只和肝硬化模型實(shí)驗(yàn)組20只。實(shí)驗(yàn)組前兩周為誘導(dǎo)期，苯巴比妥鈉0.35 g/L當(dāng)做飲用水使用，普通飼料喂養(yǎng)。之后6～8周的成模期，10% CCl4混合油溶液，劑量0.5 mL/100 g，皮下多點(diǎn)注射或腹腔注射，每周2次，10%乙醇為飲用水使用，普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)過程注意體重變化，體重降低10%，改為正常飲用水使用。對(duì)照組普通飼料加清水喂養(yǎng)。1.3.3 BMSCs的移植：每只小鼠注入BMSCs 1 mL，細(xì)胞數(shù)量為3×105個(gè)，正常對(duì)照組不進(jìn)行移植，實(shí)驗(yàn)組分為肝動(dòng)脈和尾靜脈兩種途徑移植BMSCs，各8只小鼠。（1）肝動(dòng)脈途徑：無菌手術(shù)條件下進(jìn)行操作，暴露腹腔，找到肝總動(dòng)脈、肝固有動(dòng)脈和胃十二指腸動(dòng)脈，在手術(shù)顯微鏡下，結(jié)扎胃十二指腸動(dòng)脈遠(yuǎn)端，動(dòng)脈夾阻斷肝總動(dòng)脈血流，胰島素注射器在胃十二指腸動(dòng)脈結(jié)扎的前方快速注入BMSCs懸液，結(jié)扎胃十二指腸動(dòng)脈前端，復(fù)通肝總動(dòng)脈，關(guān)閉腹腔。（2）尾靜脈途徑：固定住大鼠尾巴，用酒精棉球反復(fù)擦拭距尾巴根部2 cm處皮膚，使得尾靜脈可見，1 mL注射器緩慢注入BMSCs懸液。移植后4周時(shí)間中，繼續(xù)皮下注射10% CCl4溶液。

2　結(jié)果

2.1BMSCs的觀察

培養(yǎng)箱放置48 h，進(jìn)行換液，用PBS沖洗兩次，加入適量的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞接近90%融合時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞的形態(tài)，可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起，梭形細(xì)胞為主，胞漿豐富，胞核大、核仁清晰，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，原代培養(yǎng)第6天顯微鏡結(jié)果見圖1。

圖1　倒置顯微鏡圖（×200）

2.2BMSCs的鑒定

收獲3代以內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，用PBS（含1% BSA）清洗細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，各管依次加入單克隆抗體CD90、CD105、CD29、CD14、CD31、CD11b、CD34、CD73、CD45。同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對(duì)照。避光冰上孵育45 min，用PBS（含1% BSA）洗滌細(xì)胞3次，以除去未結(jié)合抗體，用500 μL PBS（含1% BSA）重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)果顯示CD105、CD73、CD29、CD90的陽性表達(dá)率≥95%，CD14、CD11b、CD34、CD45、CD31的陽性表達(dá)率≤2%，符合干細(xì)胞的基本特性。見圖2。

2.3肝硬化小鼠造模結(jié)果

8～10周后，正常對(duì)照組的小鼠全部存活，毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)好，體重增加，對(duì)外界刺激反應(yīng)敏感。肝硬化模型實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡4只，其余毛發(fā)變黃，凌亂無光澤，精神萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。肉眼觀察小鼠肝臟表面形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地，病理切片，行HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)果見圖3～4。

圖2　流式細(xì)胞圖

圖3　正常對(duì)照組小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

圖4　肝硬化模型實(shí)驗(yàn)組小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

2.4BMSCs移植結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中，肝動(dòng)脈組2只小鼠死亡，尾靜脈組1只小鼠死亡，其余實(shí)驗(yàn)組小鼠生活狀態(tài)類似，未見明顯的異常。4周后，處死小鼠，肉眼觀察肝臟組織，進(jìn)行病理組織切片和HE染色，結(jié)果顯示肝硬化得到一定程度的改善，兩種途徑對(duì)肝硬化的效果無太大的差異。見圖5～6。

3　討論

關(guān)于小鼠BMSCs的基礎(chǔ)研究方面，目前，培養(yǎng)BMSCs方法包括全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法、紅細(xì)胞裂解法等［5-6］，本實(shí)驗(yàn)所采用的全骨髓貼壁培養(yǎng)法，具有實(shí)驗(yàn)步驟少、細(xì)胞貼壁時(shí)間短、細(xì)胞數(shù)量多，可以更好的保持細(xì)胞的活性狀態(tài)，并不改變胞形態(tài)、免疫表型等優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)BMSCs的鑒定首先通過倒置顯微鏡對(duì)其進(jìn)行基本的形態(tài)學(xué)觀察，一般情況下，細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈梭形、纖維狀或紡錘狀，細(xì)胞密度較高時(shí)成簇狀聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象，會(huì)呈放射狀排列；然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記，借助BMSCs表面抗原性，選擇BMSCs較特異性標(biāo)志的細(xì)胞表面的黏附分子，得到抗體的陰性和陽性表達(dá)率，從而判斷所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為干細(xì)胞。構(gòu)建一種穩(wěn)定、可靠、模擬性強(qiáng)的肝硬化小鼠模型，可以對(duì)此類疾病及其相關(guān)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，此類方法包括以CCl4為主誘導(dǎo)、CCl4和乙醇復(fù)合高脂肪飲食為主誘導(dǎo)、二甲基亞硝胺、硫代乙酞胺、酒精、血清免疫法等進(jìn)行建立肝硬化模型［7-8］。本實(shí)驗(yàn)使用CCl4、乙醇復(fù)合高脂肪飲食為主誘導(dǎo)的肝硬化模型，其為多因素導(dǎo)致動(dòng)物肝硬化，可節(jié)約時(shí)間、成功率高、死亡率低，具有簡(jiǎn)便易行、價(jià)廉及病變典型等優(yōu)點(diǎn)，有助于研究外在因素對(duì)肝硬化進(jìn)程的干預(yù)作用。

圖5　BMSCs移植小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

圖6　BMSCs移植小鼠肉眼和光鏡下肝臟組織圖片

通過肝動(dòng)脈和尾靜脈兩種途徑對(duì)肝硬化小鼠進(jìn)行BMSCs移植治療，治療效果相當(dāng)，一方面可能因?yàn)榻馄蕦W(xué)特點(diǎn)，某種程度上影響了移植途徑的選擇，另一方面由于干細(xì)胞自身具有趨化和旁分泌作用，促使不同途徑移植的干細(xì)胞都遷徙到損傷的肝臟，同時(shí)分泌的多種因子隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，進(jìn)一步改善肝臟功能，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。由此可見，干細(xì)胞對(duì)肝硬化的治療作用不完全取決于移植途徑，可進(jìn)一步試驗(yàn)多種移植途徑對(duì)多種肝硬化動(dòng)物模型的作用，從而獲得更為完整的研究數(shù)據(jù)。

在臨床上，BMSCs是肝硬化時(shí)肝細(xì)胞的主要來源，在特定環(huán)境下可分化成肝干細(xì)胞及肝細(xì)胞，為細(xì)胞移植治療終末期肝病的靶細(xì)胞。BMSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，被認(rèn)為是引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞［9-11］。陳陽述等［12］臨床上針對(duì)33名肝硬化患者進(jìn)行自體BMSCs移植治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟代謝功能提高，同時(shí)患者腹脹、黃疸等癥狀顯著改善，自體BMSCs經(jīng)過體外分離再將其植入患者肝臟內(nèi)，促進(jìn)了內(nèi)源性肝細(xì)胞的增殖過程，避免排斥反應(yīng)，加快了肝組織的恢復(fù)。

BMSCs移植治療肝硬化是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，近年來對(duì)其研究逐漸深入，經(jīng)過動(dòng)物模型及臨床的研究，已經(jīng)證實(shí)其有效性，臨床上成功治療的案例，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。但是依舊存在需要探討的問題，基礎(chǔ)研究方面，缺乏特異性對(duì)人體無損害又便于跟蹤的移植細(xì)胞標(biāo)記物；臨床應(yīng)用方面，干細(xì)胞多種移植途徑的效果和可行性仍需要臨床上隨機(jī)對(duì)照及雙盲研究的治療數(shù)據(jù)，以便得出更科學(xué)的結(jié)論。

參考文獻(xiàn)：

［1］ KARAGIANNI M， KINZEBAEH S. A comparative analsis of the adipogenie pntential in human mesenchunal stromal cellsfrom cord blood and other sources ［J］. Cytotherapy， 2013，15（1）: 76-88.

［2］ XUE H L， ZENG W Z， WU X L， et al. Clinical therapeutic effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cellstransplantation in the treatment of end-stage liver disease ［J］. Transplant Proc， 2015， 47（2）: 412-418.

［3］ ROURA S， GáLVEZ-MONTóN C， BAYES-GENIS A. Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells: new therapeutic weapons for idiopathic dilated cardiomyopathy ［J］. Int J Cardiol， 2014， 177（3）: 809-818.

［4］ REINDERS M E， DE FIJTER J W， ROELOFS H， et a1. Autologons bone marrowderived Mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: resμLts of a phase I study ［J］. Stem Cells Transl Med， 2013，2（2）: 107-111.

［5］ LEE D H， LEE M J， KIM Y S， et al. Sample rotation angle dependence of graphene thickness measured using atomic force microscope ［J］. Carbon， 2015， 81（3）: 210-215.

［6］ OTABE KOJI， NAKAHARA HIROYUKI， HASEGAWA AKIHIKO， et al. Transcription Factor Mohawk Controls Tenogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro and In Vivo ［J］. J Orthop Res， 2015， 33 （1）: 1-8.

［7］ ANDREWS SIMON， REZA SALEHAN， MOHAMMAD. Morse Ruth. Effects of Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cells on genotoxic sensitivity of Myeloma cells to Melphalan in vitro ［J］. Mutagenesis， 2014， 29（7）: 527-528.

［8］ HUA PING， WANG YOU-YU， LIU LI-BAO， et al. Invivo magnetic resonance imaging tracking of transplanted superparamagnetic iron oxide labeled bone marrow mesenchymal stem cells in rats with myocardial infarction ［J］. Mol Med Rep， 2014， 11（11）: 113-120.

［9］ SVYSTONYUK D A， NGU J M， MEWHORT H E， et al. Fibroblast growth factor-2 regμLates human cardiac myofibroblast-mediated extracellμLar matrix remodeling ［J］. J Transl Med， 2015， 13（1）: 147.

［10］ SEEBER A， MARTOWCIZA A， Spizzo G， et al. Soluble Ep-CAM levels in ascites correlate with positive cytology and neutralize catumaxomab activity in vitro ［J］. BMC Cancer，2015， 15（1）: 372.

［11］ PARK J H， HONG J. Continuous release of bFGF from mμLtilayer nanofilm to maintain undifferentiated human iPS cell cμLtures ［J］. Inegrative Biology， 2014， 6（12）: 1196-1200.

［12］ 陳陽述， 歐陽石， 程濤， 等.自體骨髓干細(xì)胞移植治療失代償期乙型肝炎肝硬化臨床觀察 ［J］. 實(shí)用肝臟病雜志， 2013，16（2）： 116-118.

（本文編輯：張和，魯翠濤）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

·論著 基礎(chǔ)研究·

Research of bone marrow mesenchymal stem cells on the cirrhosis model in mice

NIU Yan-jun1，LI Ying2， WU Yong-na2， YAN Xiang1.1Department of Geriatrics；2Gansu Key Laboratory of Biotherapy and Regenerative Medicine， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China

AbstractObjective To explore the cultivation of mice bone marrow mesenchymal stem cells and the preparation of mice liver cirrhosis model， as well as the interaction of two methods. Methods First of all， the mice BMSCs were extracted to culture bottle， further separated and cultured in vitro； then， mice liver cirrhosis model was prepared by the approach of CCl4-based； finally， BMSCs were transplanted into mice liver cirrhosis model through the hepatic artery and tail vein. Results According to the expression of monoclonal antibodies， the mice BMSCs were identified by means of flow cytometry and cultured successfully； mice liver tissue was executed via pathological section， the pathological findings reported typical cirrhosis and modelled successfully； BMSCs transplantation therapy had a certain effect was proved by final pathology results and cirrhosis abated. Conclusion It is effective that autologous BMSCs transplantation treat liver cirrhosis， but basic research and a large sample of clinical data are still demanded.

Key wordsbone marrow mesenchymal stem cells； cirrhosis model； mice； transplant

［通訊作者簡(jiǎn)介］嚴(yán)祥，教授，E-mail：yanxiang528@sohu.com。

［第一作者簡(jiǎn)介］牛艷君（1989-），女，陜西延安人，碩士。

［基金項(xiàng)目］甘肅省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（1302FKDA029）。

［收稿日期］2015-12-15

［中圖分類號(hào)］R657.3+1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.007