308nm準(zhǔn)分子激光對斑塊型銀屑病患者皮損中IL-17、CD4表達(dá)的影響

陳福娟，丁楊峰，于寧，陸家睛，易雪梅（上海市皮膚病醫(yī)院，上海200443）

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308nm準(zhǔn)分子激光對斑塊型銀屑病患者皮損中IL-17、CD4表達(dá)的影響

陳福娟，丁楊峰，于寧，陸家睛，易雪梅
（上海市皮膚病醫(yī)院，上海200443）

摘要：目的采用308nm準(zhǔn)分子激光治療斑塊型銀屑病，治療前后用免疫組化法檢測組織中IL-17、CD4的表達(dá)，為闡明308nm準(zhǔn)分子激光治療斑塊型銀屑病的機(jī)制提供理論依據(jù)。方法取20例斑塊型銀屑病患者皮損和10例正常人對照者皮膚，308nm準(zhǔn)分子激光照射治療前后用免疫組化法檢測組織中IL-17、CD4表達(dá)。結(jié)果銀屑病患者皮損中可見IL-17、CD4+T細(xì)胞浸潤，主要集中在真皮淺層血管周圍；而正常皮膚組織僅有微量CD4+T、IL-17細(xì)胞表達(dá)。采用308nm準(zhǔn)分子激光照射治療后患者皮損IL-17、CD4陽性水平均顯著下降（P＜0.001）。結(jié)論銀屑病患者皮損內(nèi)IL-17、CD4細(xì)胞數(shù)目增多，表示其可能與銀屑病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。顯著降低皮損中IL-17、CD4陽性水平可能是308nm準(zhǔn)分子激光治療作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：銀屑??；308nm準(zhǔn)分子激光；CD4+T淋巴細(xì)胞；白細(xì)胞介素17

Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1、Th2的CD4+T細(xì)胞，其不產(chǎn)生IL-4或IFN-γ，而特征性地產(chǎn)生IL-17、IL-22等。Th17具有獨立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，在自身免疫性疾病和感染性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。筆者取20例斑塊型銀屑病患者皮損和10例正常人對照者皮膚，采用308nm準(zhǔn)分子激光照射治療前后免疫組化法檢測組織中IL-17、CD4表達(dá)，探討308nm準(zhǔn)分子激光治療斑塊型銀屑病的機(jī)制。

1　病例與方法

1.1臨床資料入選病例為2012年12月—2014年7月在本中心門診確診的銀屑病患者20例，男15例，女5例，平均年齡（50.75±14.78）歲，平均病程（6.65±4.09）年，所選病例近1個月未作局部治療，2個月內(nèi)未作任何免疫抑制劑治療，無其他免疫性皮膚病及系統(tǒng)性疾病。10例正常皮膚組織標(biāo)本來源于我院皮膚外科的健康人，男8例，女2例，平均年齡（49.30±15.76）歲，觀察前1個月內(nèi)無細(xì)菌、真菌、病毒感染，既往無銀屑病等免疫相關(guān)皮膚疾病。2組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器308nm準(zhǔn)分子激光儀（重慶德馬光電技術(shù)有限公司，型號：XECL-308），70℃烤箱（上海成順儀器儀表有限公司），石蠟切片機(jī)（日本PIKASEIKO LID），醫(yī)用高壓鍋（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），電子顯微鏡（日本O1ympus公司），PBS緩沖液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號PBS-0060），Anti-CD4 antibody（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號RMA -0620），Anti -IL17 antibody（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號MAB-0021），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號DAB-2031），中性樹膠（北京康為，CW0136），即用型免疫組化E1ivision p1us試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號：KIT-9901）。

1.3方法

1.3.1308nm準(zhǔn)分子激光照射試驗組給予308nm準(zhǔn)分子激光局部照射2次/周，照射前測定MED，患者初始劑量為1倍的MED，每次劑量均在前次照射劑量的基礎(chǔ)上增加10%～25%，如果局部出現(xiàn)明顯紅斑，則減少前次照射劑量的10%；如出現(xiàn)痛性紅斑或水皰則停止照射1次或2次。療程為10次，如照射部位痊愈則停止照射308nm準(zhǔn)分子激光。觀察時間為每周1次，隨訪5次。

1.3.2治療前后免疫組化法檢測組織中IL-17、CD4表達(dá)308nm準(zhǔn)分子激光對尋常型銀屑病患者外周血和皮損中Th17細(xì)胞及相關(guān)因子的影響研究①石蠟切片4μm厚，用防脫片劑多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，置烤箱65℃，6h。②脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各8min。③水化：100%乙醇5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，蒸餾水燒杯中泡2min。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗3次×3min。④高溫高壓抗原修復(fù)：取足量PH6.0檸檬酸緩沖液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將切片置入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱到噴氣閥開始噴氣。1.5min后壓力鍋離開熱源，1min后自來水輕淋鍋體冷卻至室溫（約20min），取出切片，PBS洗3次×3min。⑤滴加一抗，以PBS代替一抗作空白對照，4℃冰箱孵育過夜。PBS洗3次×3min。⑥滴加聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20min。PBS洗3次×3min。⑦滴加酶標(biāo)抗鼠聚合物，室溫孵育30min。PBS洗3次×3min。⑧DAB顯色：蒸餾水1mL，加顯色試劑盒內(nèi)A、B試劑各1滴，充分混勻，室溫下避光顯色5min，自來水沖洗10min。⑨蘇木素復(fù)染5min，自來水返藍(lán)10min。逾梯度乙醇逐級脫水，75%乙醇5min，85%乙醇5min，95%乙醇5min，100%乙醇5min。11○烘干，中性樹膠封片。

1.3.3免疫組化染色結(jié)果判定IL-17表達(dá)陽性為細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)淡黃或棕黃色顆粒，CD4表達(dá)陽性為表皮，真皮乳頭及真皮淺層T淋巴細(xì)胞胞膜出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒。結(jié)果分析每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野（×100），計數(shù)IL-17+、CD4+免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量，每種陽性細(xì)胞數(shù)量以每個高倍視野中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，光療前斑塊型銀屑病與正常對照組，斑塊型銀屑病光療前和光療后IL-17、CD4陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較用t檢驗。

2　結(jié)果

正常皮膚組織僅有微量CD4+、IL-17表達(dá)，見圖1、2，銀屑病患者皮損中可見IL-17、CD4+T細(xì)胞表達(dá)，主要集中在真皮淺層血管周圍，見圖3、4，采用308nm準(zhǔn)分子激光照射治療后患者皮損IL-17、CD4+水平均顯著下降（P＜0.001），見圖5、6，見表1。

3　討論

表1　光療前、光療后IL-17、CD4的表達(dá)?。?±s）

圖1　健康對照組CD4細(xì)胞陽性表達(dá)（SP染色×100）

圖2　健康對照組IL-17細(xì)胞陽性表達(dá)（SP染色×100）

圖3　光療前銀屑病皮損CD4細(xì)胞陽性表達(dá)（SP染色×100）

圖4　光療前銀屑病皮損IL-17陽性表達(dá)（SP染色×100）

圖5　光療后銀屑病皮損CD4細(xì)胞陽性表達(dá)（SP染色×100）

圖6　光療后銀屑病皮損IL-17表達(dá)（SP染色×100）

長久以來，認(rèn)為銀屑病發(fā)病是Th1和Th2細(xì)胞的比例失調(diào)，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞過度活化從而引起銀屑病發(fā)病是中心環(huán)節(jié)。過去的5年，銀屑病發(fā)病機(jī)制研究熱點主要聚焦于Th17細(xì)胞及相關(guān)因子［1］。目前研究認(rèn)為，銀屑病是多基因遺傳背景下T細(xì)胞異常表達(dá)的免疫性疾病，T細(xì)胞活化是銀屑病細(xì)胞免疫發(fā)病的重要機(jī)制，多種免疫相關(guān)細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)形成免疫炎癥致病網(wǎng)絡(luò)［2］。傳統(tǒng)上將Th細(xì)胞分為Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞3個亞群，分別分泌IL-2、IFN-γ和IL-4、IL-5，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答［3］。Th17細(xì)胞是近年來研究發(fā)現(xiàn)的兩種不同于Th1、Th2的CD4+細(xì)胞［4-5］。介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞與介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)胞都來源于初始T細(xì)胞，Th17是產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞能特異性地分泌以IL-17為主的細(xì)胞因子［6］，在多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病中介導(dǎo)免疫損傷。Lowes等［7］發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞主要存在于銀屑病患者皮損處的真皮層，并且其mRNA表達(dá)與疾病活動程度相關(guān)。2012年3月，Craig和Kim等［8-9］發(fā)表在《新英格蘭雜志》上的2項研究成果顯示，中/重度銀屑病新的靶向治療IL-17阻斷劑ixekizumab改善了約77%的患者（最低劑量）和82%的患者（最高劑量）75%的銀屑病斑塊；IL-17受體抑制劑broda1umab改善了77%和82%的患者至少75%的病損。Th17細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病中的作用受到越來越多的實驗研究所證實。

308nm準(zhǔn)分子激光在1997年首次用于局限性銀屑病治療，與Nb-UVB大面積暴露在紫外光下相比更加安全有效［10］。但其具體治療機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為T淋巴細(xì)胞是308nm準(zhǔn)分子激光作用的靶細(xì)胞。通過誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。James等［11］應(yīng)用UVB治療9例銀屑病患者，經(jīng)過4～5周照射后照射部位組織行免疫組化染色，結(jié)果顯示表皮部位90%的T淋巴細(xì)胞被清除。楊慧蘭等［12］應(yīng)用308nm準(zhǔn)分子激光照射角質(zhì)形成細(xì)胞和體外分離的活動期白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示308nm準(zhǔn)分子激光可直接和間接誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損中可見IL-17、CD4+T細(xì)胞浸潤，主要集中在真皮淺層血管周圍；而正常皮膚組織僅有微量CD4+T、IL-17細(xì)胞表達(dá)。采用308nm準(zhǔn)分子激光照射治療后患者皮損IL-17、CD4陽性水平均顯著下降。提示308nm準(zhǔn)分子激光照射可能通過下調(diào)皮損IL-17、CD4陽性水平的表達(dá)減輕炎癥細(xì)胞的浸潤程度，從而發(fā)揮良好的治療作用。UVB能誘導(dǎo)銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞凋亡，與傳統(tǒng)UVB相比較，308nm準(zhǔn)分子激光產(chǎn)生的UVB引起T細(xì)胞凋亡的能力顯著增強(qiáng)。另外，308nm準(zhǔn)分子激光能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究中發(fā)現(xiàn)308nm準(zhǔn)分子激光可能通過同時降低皮損中IL-17、CD4的表達(dá)，從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，減少T淋巴細(xì)胞的浸潤，減少局部的炎癥反應(yīng)，在銀屑病治療中發(fā)揮重要作用。

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資助項目：上海市科委課題（12411951702）；上海市衛(wèi)生局課題（20124126）

收稿日期：（2015-06-04）

中圖分類號：R758.63

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1672-0709（2016）02-0111-03