NK-2受體參與小鼠斷尾誘發(fā)的扣帶回前部神經(jīng)元Fos蛋白表達

張雅娟，楊宇，李娜然，商麗宏，吳孟霏，吳敏范*

(1.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內科，遼寧沈陽110023；2.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學教研室；3.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室；4.遼寧何氏醫(yī)學院)

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NK-2受體參與小鼠斷尾誘發(fā)的扣帶回前部神經(jīng)元Fos蛋白表達

張雅娟1，楊宇2，李娜然3，商麗宏2，吳孟霏4，吳敏范2*

(1.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內科，遼寧沈陽110023；2.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學教研室；3.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室；4.遼寧何氏醫(yī)學院)

[摘要]目的：探討小鼠斷尾能否改變扣帶回前部(anterior cingulate gyrus，ACG)神經(jīng)元Fos蛋白表達及NK-2受體在此變化中的作用。方法：采用免疫組織化學方法觀察截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h小鼠ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達變化及蛛網(wǎng)膜下腔注射MEN-10,376(NK-2受體拮抗劑)對該變化的影響。結果：小鼠截斷尾后0.5 h，ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達顯著增強；蛛網(wǎng)膜下腔注射MEN-10,376完全拮抗了截斷尾誘發(fā)的ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達顯著增強，差異均有統(tǒng)計學意義。結論：中樞NK-2受體參與小鼠截斷尾引起ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達顯著增強過程。

[關鍵詞]幻肢痛；扣帶回前部；Fos蛋白；MEN-10,376；NK-2受體

幻肢痛(phantom limb pain，PLP)是截肢患者主觀感覺已經(jīng)被切除的肢體仍然存在，并伴有不同程度及不同性質疼痛的現(xiàn)象。有研究報道，60%以上截肢患者術后伴有PLP[1]；扣帶回前部(anterior cingulate gyrus，ACG)是重要的痛覺中樞之一[2-3]；PLP患者的ACG神經(jīng)元活動發(fā)生明顯的改變[4]；大鼠截肢后ACG對中樞刺激及外周刺激反應增強[5]；手術截斷小鼠尾末端常用于研究PLP產生的中樞機制[6-7]。目前，PLP發(fā)病機制尚不清楚。研究表明c-fos即刻早基因及Fos蛋白表達標志著傷害性信息傳導通路中傷害性感受神經(jīng)元興奮[8]，速激肽NK-2受體參與下肢皮下注射福爾馬林作為痛刺激引起的室旁核神經(jīng)元Fos蛋白表達顯著增加的過程[9]。但是，截斷小鼠尾末端能否引起ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達的改變及速激肽NK-2受體是否參與該過程尚未見報道。本實驗應用免疫組織化學法對此進行研究，以期闡明速激肽NK-2受體在傷害性信息傳遞和調制中的作用，深入研究PLP的產生機制，為臨床治療PLP提供科學實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物成年昆明種小鼠24只，雌性，體重(27±6)g，由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供(動物生產許可證號：SCXK(遼)2010-0001)。MEN-10,376(Sigma，美國)，DAB試劑盒、ABC試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2分組及給藥方法小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)麻醉后，隨機分為4組，各6只?？瞻讓φ战M；斷尾后0.5 h組(即用手術剪刀截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h實驗組)；MEN-10,376(NK-2受體拮抗劑)組(將MEN-10,376 10 μg混于10 μl生理鹽水中蛛網(wǎng)膜下腔注射后10 min截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h實驗組)；生理鹽水組(同體積生理鹽水蛛網(wǎng)膜下腔注射后10 min截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h對照組)。

1.3ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達檢測迅速將上述各組小鼠斷頭，在冰臺上取腦，置入4 ℃ 4%多聚甲醛中過夜固定。連續(xù)冠狀-20 ℃冰凍切片，厚度為15 μm，采用免疫組化法常規(guī)染片及洗片等，最后采用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀檢測切片ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達陽性細胞積分光密度和面積百分比。

2結果

與空白對照組比較，斷尾后0.5 h組、生理鹽水組ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達陽性細胞積分光密度及面積百分比均顯著增加(P<0.01)；MEN-10,376組ACG神經(jīng)元的陽性細胞積分光密度及面積百分比無明顯增加(P>0.05)。與斷尾后0.5 h組、生理鹽水組比較，MEN-10,376組ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1　MEN-10,376蛛網(wǎng)膜下腔注射對截斷尾

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與斷尾后0.5 h組、生理鹽水組比較，2)P<0.05

A：空白對照組；B：斷尾后0.5 h組；C：生理鹽水組；D：MEN-10,376組圖1　4組小鼠ACG神經(jīng)元Fos蛋白的表達(免疫組化染色，×400)

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對刺激產生反應的疼痛標志物Fos蛋白的表達，標志著傷害性感受神經(jīng)元興奮，F(xiàn)os蛋白表達的部位常常是與傷害性傳入信息傳遞、整合等有關的區(qū)域[8]；截肢的大鼠ACG神經(jīng)元活動發(fā)生明顯改變[5]。本實驗觀察到在空白對照組ACG神經(jīng)元有少量的Fos蛋白表達；截斷小鼠尾末端后0.5 h ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達顯著增加。因此，我們認為在正常情況下ACG神經(jīng)元存有Fos蛋白較低水平的表達；ACG神經(jīng)元能夠感受小鼠斷尾傳入的傷害性信息，引起Fos蛋白表達顯著增加，ACG神經(jīng)元參與斷尾后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化。本實驗結果為深入研究PLP提供了實驗依據(jù)。

PLP是截肢患者常見的并發(fā)癥之一。目前，關于PLP產生的原因尚不清楚，無理想的治療方法。速激肽NK-2受體與痛覺有關[10]。但是，截斷尾末端增加ACG神經(jīng)元的Fos蛋白表達過程是否有NK-2受體參與尚未見報道。本實驗觀察到NK-2受體拮抗劑MEN-10,376能夠拮抗截斷尾末端引起的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達顯著增加，提示中樞NK-2受體參與了截斷尾末端引起的ACG神經(jīng)元Fos蛋白表達的顯著增加過程，NK-2受體可能為治療PLP的潛在靶點之一。

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(文敏編輯)

NK-2 Receptor Involved in Fos Protein Expression of Anterior Cingulate Gyrus Neurons Evoked by Amputation of the Tail Extremity of Mice

ZHANG Yajuan1,YANG Yu2,LI Naran3,SHANG Lihong2,WU Mengfei4,WU Minfan2*

(1.Department of Neurology，The Fifth People's Hospital of Shenyang，Shenyang 110023,China；2.Department of Physiology，Shenyang Medical College；3.Laboratory of Morphology，Shenyang Medical College；4.He University)

[Abstract]Objective:To approach whether amputation of tail extremity of mice could evoke Fos protein expression change in ACG neurons and the role of NK-2 receptor in the change.Methods:Immunohistochemistry method was used to study Fos protein expression change in mice ACG neurons at 0.5 h after amputation of the tail extremity 2.5 cm,and effect of NK-2 receptor antagonist MEN-10,376(intrathecal injection) on the change.Results:Fos protein expression in mice ACG neurons significantly increased at 0.5 h after the amputation.MEN-10,376 completely antagonized the significant increase in Fos protein expression in mice ACG neurons after the amputation.There were significant differences.Conclusions:Amputation of the tail extremity can significantly increase the Fos protein expression of mice ACG neurons.Central NK-2 receptors are involved in the process.

[Key words]phantom limb pain；anterior cingulate gyrus；Fos protein；MEN-10,376；NK-2 receptor

[收稿日期]2015-12-25

doi:10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.02.002

[中圖分類號]R338；Q432

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-2344(2016)02-0068-02

[作者簡介]張雅娟(1969—)，女(漢)，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：痛覺及鎮(zhèn)痛機制．[通訊作者]吳敏范(1963—)，女(滿)，博士，教授，研究方向：痛覺及鎮(zhèn)痛機制．E-mail：minfanwu0594@sina.com.cn

[基金項目]沈陽市科技局計劃項目(No.F13-220-9-45)；遼寧省科技廳基金項目(No.L2015020391)