應(yīng)用胚胎干細(xì)胞模型研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物胚胎毒性的展望

馬明月

(沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧沈陽110034)

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應(yīng)用胚胎干細(xì)胞模型研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物胚胎毒性的展望

馬明月

(沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧沈陽110034)

[摘要]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物具有一定的胚胎毒性，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性，尋找替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭陵P(guān)重要。目前，胚胎干細(xì)胞已成為發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的一種嶄新受試對(duì)象，能靈敏、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)有害物質(zhì)的毒性作用。根據(jù)胚胎干細(xì)胞特性發(fā)展起來的胚胎干細(xì)胞模型，可評(píng)價(jià)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的潛在胚胎毒性和致畸性。

[關(guān)鍵詞]胚胎干細(xì)胞；環(huán)境內(nèi)分泌干擾物；胚胎毒性

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EEDs)是指環(huán)境中天然存在或污染的，可模擬生物體內(nèi)激素生理、生化作用，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，對(duì)親體或后代產(chǎn)生不良健康效應(yīng)的外源化學(xué)物。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters， PAEs)作為最具代表性的EEDs[1]，每年全球范圍內(nèi)的使用量很大，廣泛應(yīng)用于兒童玩具、醫(yī)療用品、食品包裝材料、化妝品中。由于在塑料制品加工過程中，PAEs并未聚合到PVC高分子的碳鏈上，隨著時(shí)間的推移，可不斷地被釋放出來。PAEs難以被降解，廣泛存在于土壤、水域、空氣中，造成環(huán)境污染。人類尿液、血液、乳汁中均可檢測(cè)到多種PAEs及其代謝產(chǎn)物[2-4]。近年來，許多證據(jù)顯示PAEs暴露與出生缺陷、生殖異常和代謝相關(guān)性疾病密切相關(guān)[5-7]。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)是PAEs中使用最多的化學(xué)物，可通過消化道、呼吸道、皮膚等多種途徑進(jìn)入人體，亦可通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，在胎兒體內(nèi)聚集[8]。但EEDs的胚胎毒性研究還主要停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，利用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)建立發(fā)育毒物體外預(yù)測(cè)模型，可評(píng)價(jià)化學(xué)物的潛在胚胎毒性和致畸性。本文就DEHP等EEDs的胚胎毒性，ESC在胚胎發(fā)育毒性研究中的應(yīng)用、優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意義進(jìn)行綜述。

1DEHP胚胎毒性研究的進(jìn)展

大量動(dòng)物研究證明DEHP具有胚胎毒性，影響胚胎、胎兒發(fā)育。早在1994年，Hansen等[9]應(yīng)用大鼠全胚胎培養(yǎng)(whole embryo culture，WEC)證實(shí)DEHP原形直接作用于胚胎影響其生長(zhǎng)和發(fā)育；Robinson等[10]通過大鼠植入后WEC，研究了DEHP的活性代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單(2-乙基)己酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)對(duì)WEC的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)變化和形態(tài)異常的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEHP可以誘導(dǎo)膽固醇-脂質(zhì)-類固醇代謝(CLS)增強(qiáng)和凋亡途徑，較經(jīng)典形態(tài)學(xué)改變更為敏感。因此，調(diào)控CLS代謝途徑與PAEs宮內(nèi)暴露導(dǎo)致的發(fā)育毒性相關(guān)[11]。在妊娠早期暴露DEHP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，母體肝臟中金屬硫蛋白-1(metallothionein，MT-1)、金屬硫蛋白-2(metallothionein，MT-2)、鋅運(yùn)轉(zhuǎn)體蛋白(zinc transporter， ZnT-1)表達(dá)上升，而胎鼠腦組織中MT-1、MT-2和ZnT-1表達(dá)下降，因此鋅代謝紊亂可能與DEHP 的胚胎毒性有關(guān)[11]。孕期DEHP暴露通過表觀遺傳機(jī)制影響某些維持胚胎正常發(fā)育的印記基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎和胎盤發(fā)育[12]。最新的研究表明PAEs及雙酚A等EEDs阻礙正常的胚胎發(fā)育，是通過影響發(fā)育的某一階段表觀遺傳調(diào)控導(dǎo)致表型的變化，并且這些變化能夠長(zhǎng)久地遺傳給后代[13-14]。實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段以及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)限制了早期胚胎宮內(nèi)研究，且研究主要停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，這使得EEDs對(duì)胎兒宮內(nèi)發(fā)育的影響及其可能的機(jī)制知之甚少[15]。

2ESC在胚胎發(fā)育毒性研究中的應(yīng)用及優(yōu)勢(shì)

近二十年來，隨著干細(xì)胞研究方法的日臻成熟，ESC已成為發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的一種嶄新受試對(duì)象，能靈敏、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)有害物質(zhì)的毒性作用[16-17]。在適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)條件下，ESC能分化出包括原始外胚層、內(nèi)胚層以及早期中胚層的多種細(xì)胞譜系，并產(chǎn)生各種細(xì)胞類型。由于缺乏空間調(diào)控信號(hào)，ESC不能完成各組織的形態(tài)發(fā)育，但能在細(xì)胞核分子水平重演胚胎發(fā)育過程，并且在胚體分化過程中，早期胚胎發(fā)育的標(biāo)志基因按一定的順序先后表達(dá)，同時(shí)各組織特異性基因的表達(dá)的順序也很好地重演了體內(nèi)胚胎發(fā)育的基因表達(dá)模式[18-19]。

評(píng)價(jià)化學(xué)物的潛在胚胎毒性和致畸性可利用ESC建立發(fā)育毒物體外預(yù)測(cè)模型。ESC具有著床前細(xì)胞特性以及細(xì)胞毒性、增殖和分化的多終點(diǎn)評(píng)價(jià)特性，明顯提高ESC測(cè)試模型(embryonic stem cell test，EST)篩選的有效性。自2000年7月ECVAM (the European Center for the Validation of Alternative Methods)正式批準(zhǔn)EST作為體外藥物和化合物毒性篩選動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的替代方法，目前這種毒性檢測(cè)手段已為學(xué)術(shù)界普遍接受，并且作為重要的研究手段，已經(jīng)應(yīng)用于毒理學(xué)研究中[20-21]。但在化學(xué)物安全評(píng)價(jià)中仍然存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人的問題。

人ES細(xì)胞系(human embryonic stem cell，hESC)來自人類早期胚胎，代表人類的特征，不存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所特有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須外推到人的問題[22]。Pal等[23]以DNA細(xì)胞周期分析、生殖層特異性標(biāo)記表達(dá)和激素水平為終點(diǎn)評(píng)價(jià)毒物對(duì)ESC的增殖和分化的影響，從而預(yù)測(cè)毒物潛在的胚胎發(fā)育毒性。2013年，Palmer等[24]開發(fā)了一種基于hESC和代謝組學(xué)分析結(jié)合的方法，通過將hESC暴露于23種已知人類致畸物和非致畸物，然后從細(xì)胞代謝產(chǎn)物中鑒別出特異性的代謝產(chǎn)物，作為致畸性生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物具有敏感、特異、簡(jiǎn)便、無損傷等特點(diǎn)，篩選和利用其特性，可早期預(yù)測(cè)環(huán)境有害因素對(duì)機(jī)體的可能損害，并可評(píng)價(jià)其危險(xiǎn)度，對(duì)于提出切實(shí)可行的預(yù)防措施有著重大意義。利用hESC和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法去尋找發(fā)育毒性的生物標(biāo)志物，對(duì)預(yù)測(cè)藥物及化學(xué)物的發(fā)育毒性提供了新的思路。

ESC具有多能性和自我更新能力，一定條件下又能產(chǎn)生不可逆的分化。OCT-4和Nanog在保持ESC的基本特性中被認(rèn)為是2個(gè)基本調(diào)節(jié)器，SOX-2通過與OCT-4組成異二聚體發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。三者的表達(dá)水平和功能狀態(tài)直接對(duì)ESC干性維持及生物的早期發(fā)育產(chǎn)生影響。

隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳的動(dòng)態(tài)調(diào)控在ESC的自我更新和分化過程中扮演著非常重要的角色[25]。ESC在分化過程中需要經(jīng)歷長(zhǎng)期不間斷的基因表達(dá)過程，在這一過程中，與自我更新相關(guān)的基因是沉默的，而與細(xì)胞分化相關(guān)的特異基因被轉(zhuǎn)錄激活[26]。與ESC分化相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制包括：DNA的甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA。最近動(dòng)物研究表明EEDs(PAEs和雙酚A)宮內(nèi)暴露引起的表觀遺傳改變可以持續(xù)在整個(gè)生命階段誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致子代出生后生殖功能異常[27]；母體暴露DEHP，仔鼠睪丸DNA甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平明顯升高[26]。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明EEDs可以通過表觀遺傳機(jī)制影響胚胎發(fā)育并導(dǎo)致傳代效應(yīng)，但其分子機(jī)制尚未闡明。

3應(yīng)用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意義

hESC作為一種新的體外受試細(xì)胞，可以替代哺乳動(dòng)物的整體實(shí)驗(yàn)，為環(huán)境化學(xué)物的毒理研究提供豐富細(xì)胞來源。毒性物質(zhì)的定性或定量實(shí)驗(yàn)都能夠反映其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及生物學(xué)行為的影響。由于ESC的分化通常伴隨著明顯的細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，不同的組織、細(xì)胞的甲基化模式導(dǎo)致基因表達(dá)的特異性。此外，受外界環(huán)境的影響，甲基化的DNA更容易發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，改變?nèi)旧|(zhì)中組蛋白的乙?；帕蟹绞?，可能構(gòu)成基因表達(dá)的另外一種編碼[28]。

應(yīng)用hESC作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠硌芯勘碛^遺傳影響胚胎發(fā)育是非常有價(jià)值的，因?yàn)轶w外hESC誘導(dǎo)擬胚體的形成與胚胎發(fā)育的早期階段是非常相似的。加之，動(dòng)物研究證實(shí)母體接觸DEHP能影響胚胎發(fā)育，引起子代生殖功能異常，并具有傳代效應(yīng)[29]。值得深入研究的是：(1)EEDs如何引起在胚胎發(fā)育早期表觀遺傳學(xué)的改變？(2)這些改變通過什么分子靶點(diǎn)來影響ESC干性維持和定向分化？(3)并且對(duì)ESC造成怎樣的影響？(4)這些影響又如何體現(xiàn)在ESC分泌產(chǎn)生一些小分子的生物標(biāo)志物。因此，采用ESC為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停治鯡EDS對(duì)ESC干性維持及定向分化過程中關(guān)鍵基因所導(dǎo)致的表觀遺傳學(xué)影響；通過將表觀遺傳學(xué)理論和代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，闡明EEDs在胚胎發(fā)育早期對(duì)ESC的影響及分子機(jī)制，篩查敏感、特異、無損傷的早期生物標(biāo)志物和胚胎發(fā)育毒性研究具有深遠(yuǎn)意義。

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(文敏編輯)

Research Progress of Environmental Endocrine Disruptors on Embryotoxicity by Embryonic Stem Cell Test

MA Mingyue

(School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

[Abstract]Animal experimental studies demonstrated that environmental endocrine disruptors(EEDs) led to embryotoxicity.The evaluation of embryotoxicity by the animal experimental has some limitation.Replacing animals experiment has become an important role in developmental toxicology.At present,embryonic stem cells have become a new subject of developmental toxicity test.And it can assess sensitively and accurately the toxic effect of xenobiotics.Embryonic stem cell test in vitro based on the characteristic of embryonic stem cell can evaluate the potential embryotoxicity and teratogenicity of EEDs.

[Key words]embryonic stem cell; environmental endocrine disruptors; embryotoxicity

[收稿日期]2016-02-05

doi:10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.02.001

[中圖分類號(hào)]R994.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-2344(2016)02-0065-03

[作者簡(jiǎn)介]馬明月(1970—)，女(漢)，教授，博士，碩士生導(dǎo)師.研究方向：發(fā)育毒性與出生缺陷.E-mail：mymacmu@163.com

[基金項(xiàng)目]遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(No.L2014414)；沈陽市科技局項(xiàng)目(No.F14-158-9-22)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(No.20141016400006)