生長調(diào)節(jié)劑對紫花苜蓿微扦插試管苗生長的影響

張　靜，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州　730070)

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生長調(diào)節(jié)劑對紫花苜蓿微扦插試管苗生長的影響

張靜，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：以紫花苜蓿品種甘農(nóng)3號(G3)、和田(HT)、隴東(LD)為材料，研究不同種類和不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、生根粉(ABT)對苜蓿微扦插試管苗生長的影響。結(jié)果表明,0.2 mg/L NAA處理下的G3紫花苜蓿試管苗生根率達100%，且具有較高的生根數(shù)(8)，最大根長(17.5 cm)，株高和葉片數(shù)也顯著高于對照和其他處理(P<0.05)；0.1 mg/L NAA處理下的和田紫花苜蓿試管苗的根系生長狀況明顯優(yōu)于其他處理，生根率為100%，具有較高的生根數(shù)(7)，最大根長(29.6 cm)，株高和葉片數(shù)也顯著高于對照和其他處理(P<0.05)；0.2 mg/L NAA處理下的隴東紫花苜蓿試管苗的根系生長情況明顯優(yōu)于其他處理，生根率100%，并具有較高的生根數(shù)(7)，最大根長(10.2 cm)，株高和葉片數(shù)也顯著高于對照和其他處理(P<0.05)。因此，在設(shè)置的濃度梯度下,甘農(nóng)3號和隴東紫花苜蓿微扦插試管苗生長的最適生長調(diào)節(jié)劑及其濃度是0.2 mg/L NAA，適于和田紫花苜蓿的是0.1 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：生長調(diào)節(jié)劑；紫花苜蓿；試管苗；微扦插

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科牧草，品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)價值高，適口性好，是重要的飼草植物。苜蓿還具有固氮，改良土壤品質(zhì)，防風(fēng)固沙，改善生態(tài)環(huán)境等重要的生態(tài)功能。因此，培育品質(zhì)優(yōu)良、生態(tài)適應(yīng)性強的苜蓿新品種具有重要的經(jīng)濟價值和社會效益。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前熱門的育種育苗手段之一，它具有很強的針對性和目的性，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可準確獲得所需的優(yōu)良性狀。但同時，由于外源基因的導(dǎo)入存在一定的偶然性，所以獲得能表達所需性狀的轉(zhuǎn)基因再生苗的數(shù)量有限。

扦插作為一種無性繁殖手段,對苜蓿保優(yōu)傳代和加速繁殖,繁育良種具有重要意義[1]，而微扦插是組織培養(yǎng)過程中獲得大量再生苗的必要手段。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因試管苗量較少，需要通過微扦插擴繁大批的轉(zhuǎn)基因再生苗。影響試管苗微扦插繁殖效率的因素包括植物自身特性和外部因子。前者包括發(fā)育時期、生長部位及切口方式等，后者包括外源生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基和環(huán)境因子(溫度、濕度、光照等)。而外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)通過促進插穗內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)重新分配和內(nèi)源激素的表達提高細胞內(nèi)滲透壓、吸水能力和酶活性，進而使細胞順利進行脫分化和再分化，促進試管苗插穗生根[2]。

生長調(diào)節(jié)劑吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、生根粉(ABT)已廣泛應(yīng)用于各類植物的扦插繁殖，外用生長調(diào)節(jié)劑能夠促進根系發(fā)育，提高根冠比，增加枝條分蘗數(shù)[3]。如IBA可促進含笑插穗內(nèi)部的生理生化變化的進程，特別是降低了過氧化物酶(POD)和酚類物質(zhì)的含量，進而促進插穗生根[4]；不同濃度的IBA對菊花“秀芳力”插穗生根的影響不同，其中1 500 mg/L處理區(qū)的生根效果最佳[5]。ABT1號500 mg/L處理可大大提高三倍體山楊扦插繁殖生根率和成活率[6]；ABT生根粉也可用于桂花生根繁育，采用200 mg/L的處理效果最好[7]；ABT生根粉用于新疆石榴嫩枝扦插育苗，1 000 mg/L生根粉處理下生根成活率最高，1 500 mg/L 生根粉處理下生根量最大[8]。香石竹在不同濃度的NAA處理下，生根成活情況不同，500 mg/L NAA處理下，生根成活率最高[9]。

通過研究不同濃度生長調(diào)節(jié)劑IBA，NAA和ABT對3個紫花苜蓿品種微扦插試管苗生長的影響，旨在獲得3個紫花苜蓿品種試管苗微繁的最適濃度生長調(diào)節(jié)劑，為組織培養(yǎng)獲得大量轉(zhuǎn)基因試管苗提供參考。

1材料和方法

1.1供試材料

供試紫花苜蓿品種為甘農(nóng)3號(G3)、和田(HT)、隴東(LD)，紫花苜蓿品種的種子由北京克勞沃公司提供。

1.2試驗方法

1.2.1試管苗插穗的獲得選取品相優(yōu)良、飽滿有光澤的種子，自來水浸泡40 min，在超凈工作臺用75%的酒精和20%的NaCl消毒后接種于無菌MS培養(yǎng)基上，室溫條件下培養(yǎng)，待幼苗生長至5 cm，選取生長健壯的幼苗，轉(zhuǎn)移到新的無菌MS培養(yǎng)基中，每瓶5株，每個品種15瓶，轉(zhuǎn)移過程盡量減少對葉和根的損傷[10]。幼苗生長至8～10 cm，于超凈工作臺上從幼苗各個生長點剪斷獲得試管苗插穗。

1.2.2不同濃度生長調(diào)節(jié)劑及測定指標培養(yǎng)基采用1/2MS+1%蔗糖+0.7%瓊脂[11-13]，其中分別添加IBA，NAA和ABT 3種外源生長調(diào)節(jié)劑，設(shè)置濃度梯度0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L NAA，0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L IBA，0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L ABT，共16個處理，以不加任何生長調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基為對照(CK)，對照和處理均重復(fù)3次，每個重復(fù)接種4株。人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件在25 ℃、16 h光照，光強為1 600～2 000 lx，待培養(yǎng)8周后，測定其根數(shù)、最大根長、生根率、葉片數(shù)、株高5個指標[14]。各處理對應(yīng)編號1～6為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L NAA，編號7～11為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L IBA，編號12～16為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L ABT。培養(yǎng)基均121℃高壓滅菌26 min，接種工作均在超凈工作臺進行。

1.2.3數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncan法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1生長調(diào)節(jié)劑對G3紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響

2.1.1生長調(diào)節(jié)劑對G3紫花苜蓿微扦插試管苗根系影響不同濃度的NAA，IBA和ABT處理后，除3.0 mg/L ABT處理外，其他處理對G3生根有明顯促進作用。其中，0.2 mg/L NAA處理的試管苗根系生長狀況最佳，生根率達100%，植株高大健壯，根系發(fā)達，最大根長為17.5 cm，3.0 mg/L ABT處理最差，生根率為零，基部膨大形成黃綠色愈傷組織(表1)。

表1　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的甘農(nóng)3號試管苗根系生長狀況

2.1.2生長調(diào)節(jié)劑對G3紫花苜蓿微扦插試管苗株高的影響0.2 mg/L NAA處理下的試管苗株高顯著高于對照和其他處理(P<0.05)。0.05、2.0 mg/L NAA，1.0、3.0 mg/L IBA，1.0、2.0、3.0 mg/L ABT處理下的試管苗株高與對照無顯著差異(P>0.05)，其余處理下的試管苗株高均與對照差異顯著(P<0.05)(圖1)。

圖1　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的G3的試管苗株高Fig.1　The tube seedlings of plant height of Gannong no.3 alfalfa under different concentrations of growth regulators treatments注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2～6同

2.1.3生長調(diào)節(jié)劑對G3微扦插試管苗葉片數(shù)的影響0.2 mg/L NAA處理的試管苗葉片數(shù)顯著高于對照和其他處理(P<0.05)。2.0 mg/L NAA，1.0、3.0 mg/L IBA，0.1、0.5 mg/L ABT處理的試管苗葉片數(shù)與對照無顯著差異(P>0.05)，其余處理葉片數(shù)2均顯著高于對照(P<0.05)(圖2)。

2.2生長調(diào)節(jié)劑對HT紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響

2.2.1生長調(diào)節(jié)劑對HT紫花苜蓿微扦插試管苗根系生長狀況的影響試驗設(shè)置的不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對和田紫花苜蓿試管苗生根都具有促進作用，各濃度處理下的生根率都高于對照。其中，0.1 mg/L NAA和1.0 mg/L IBA處理下的試管苗生根率為100%，植株生長健壯，須根系發(fā)達，最大根長分別為29.6 cm和15.1 cm。3.0 mg/L ABT處理的試管苗根系生長狀況最差，基部先膨大形成愈傷組織，再從膨大部分生出少量簇生根，最大根長為1.1 cm(表2)。

圖2　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的G3紫花苜蓿的試管苗葉片數(shù)Fig.2　The tube seedlings of leaf number of Gannong no.3 alfalfa under different concentrations of growth regulators treatments

處理根數(shù)/條·株-1最大根長/cm生根率/%生長狀況CK32.333苗矮小,根細,發(fā)白,短165.058苗較矮,根較粗壯,發(fā)白或黃,較短2729.6100苗高大健壯,根較粗壯,發(fā)白或黃,長,須根發(fā)達346.892苗高大健壯,根較細,發(fā)白或黃,較短,須根發(fā)達462.892苗生長中等,根細,發(fā)白,短564.183苗生長中等,根細,發(fā)白或黃,較短633.742苗矮小,部分基部膨大,形成疏松愈傷組織,呈黃綠色7516.783苗較矮,根較粗壯,發(fā)白或黃,長,須根發(fā)達856.875苗生長中等,根細,發(fā)白或黃,較長9515.1100苗高大健壯,根較粗壯,發(fā)白或黃,長,須根發(fā)達10310.375苗生長中等,根較粗壯,發(fā)白,較長11313.858苗矮小,根較細,發(fā)白或黃,長,須根發(fā)達1252.883苗生長中等,根細,短,簇生狀1362.375苗較矮,根細,短,簇生狀1432.667苗較矮,根細,短,簇生狀1541.683苗生長中等,根細,短,簇生狀1681.142苗基本不生長,根細,短,簇生狀

2.2.2生長調(diào)節(jié)劑對HT紫花苜蓿微扦插試管苗株高的影響0.1 mg/L NAA處理下的試管苗株高顯著高于對照及其余處理(P<0.05)，2.0 mg/L NAA和3.0 mg/L IBA處理下的試管苗株高與對照無顯著差異(P>0.05)，3.0 mg/L ABT處理下的試管苗株高顯著低于對照(P<0.05)?？梢钥闯?，對HT紫花苜蓿試管苗株高的影響，0.1 mg/L NAA顯著高于1.0 mg/LIBA(P<0.05)(圖3)。

圖3　不同生長調(diào)節(jié)劑處理下的和田紫花苜蓿的試管苗株高Fig.3　The tube seedlings of plant height of Hetian alfalfa under different concentrations of growth regulators treatments

2.2.3生長調(diào)節(jié)劑對HT紫花苜蓿微扦插試管苗葉片數(shù)的影響0.1 mg/L NAA處理的試管苗葉片數(shù)顯著高于對照和其余處理(P<0.05)，2.0 mg/L NAA及1.0，2.0和3.0 mg/L ABT處理的試管苗與對照無顯著差異(P>0.05)。對HT紫花苜蓿試管苗葉片數(shù)的影響，0.1 mg/L NAA顯著高于1.0 mg/L IBA(P<0.05)(圖4)。

2.3生長調(diào)節(jié)劑對LD紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響

2.3.1生長調(diào)節(jié)劑對LD紫花苜蓿微扦插試管苗根系生長狀況的影響隴東紫花苜蓿對照生根率為零，不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑NAA，IBA和ABT處理，對LD紫花苜蓿生根都具有促進作用。其中，0.2 mg/L NAA和0.1 mg/L IBA處理的試管苗根系生長狀況最佳，生根率100%，植株高大健壯，根系發(fā)達，最大根長達到10.2 cm和12.1 cm。0.5 mg/L ABT處理的試管苗根系生長狀況最差，生根率僅為17%，試管苗基本不生長，生根數(shù)極少，最大根長為0.7 cm(表3)。

表3　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的甘農(nóng)3號紫花苜蓿試管苗根系生長狀況

2.3.2生長調(diào)節(jié)劑對LD紫花苜蓿微扦插試管苗株高的影響0.2 mg/L NAA處理的試管苗株高顯著高于對照和其余處理(P<0.05)，2.0 mg/L NAA和0.5 mg/L ABT處理的試管苗株高顯著低于對照(P<0.05)，1.0 mg/L NAA及0.1、1.0、2 mg/L ABT處理下的試管苗株高與對照無顯著性差異(P>0.05)。0.2 mg/L NAA處理的試管苗株高顯著高于0.1 mg/L IBA(P<0.05)(圖5)。

圖5　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的隴東紫花苜蓿的試管苗株高Fig.5　The tube seedlings of plant height of Longdong alfalfa under different concentrations of growth regulators treatments

2.3.3生長調(diào)節(jié)劑對LD紫花苜蓿微扦插試管苗葉片數(shù)的影響0.2 mg/L NAA處理下的試管苗葉片數(shù)顯著高于對和其余處理(P<0.05)，2.0 mg/L NAA處理的試管苗葉片數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，0.1，1.0、2 mg/L ABT處理下的試管苗葉片數(shù)與對照無顯著性差異(P>0.05)。同樣，對LD紫花苜蓿試管苗葉片數(shù)的影響，0.2 mg/L NAA顯著高于0.1 mg/L IBA(P<0.05)(圖6)。

3討論

試管苗微扦插繁殖能夠保持植物特有的遺傳性質(zhì)，還能在短時間內(nèi)獲得大量試管成活苗，是組織培養(yǎng)過程植物微繁的重要手段。培養(yǎng)基中加入適宜的生長調(diào)節(jié)劑，能夠提高試管苗插穗細胞滲透壓、吸水力和酶活性，使細胞順利完成脫分化和再分化，縮短生根時間、提高生根率和根系質(zhì)量[15]。在適宜的生長調(diào)節(jié)劑濃度范圍內(nèi)，加入一定濃度的生長調(diào)節(jié)劑對苜蓿試管苗根系生長都有一定的促進作用，但對G3紫花苜蓿，3.0 mg/L ABT處理下無根系生成，基部只有黃綠色愈傷組織生成。孫時軒等[16]研究表明，植物本身對外源生長調(diào)節(jié)劑的使用相對苛刻，不同生長調(diào)節(jié)劑對不同植物都有一個適宜的濃度范圍，超出范圍則會出現(xiàn)一定的毒害作用。試驗表明ABT濃度較高，超出G3紫花苜蓿最適的ABT濃度范圍，抑制G3紫花苜蓿根系的生成。王珺等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NAA濃度在0～0.5 mg/L時，甘農(nóng)4號和盛世的生根率隨著NAA濃度的增加有所增加，一旦超出這個范圍后，2品種的生根率反而下降。高明星等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)根分化以0～0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L IBA較好，高濃度的NAA有利于根的分化而抑制莖芽的形成。

試驗中，試管苗基部先膨大出現(xiàn)一定數(shù)量的愈傷組織，然后從膨大的愈傷組織部分再生出根系。郭英超等[19]發(fā)現(xiàn)，外源生長調(diào)節(jié)劑的使用，改變了苜蓿扦插基部IAA和GA的分布，基部IAA的含量顯著增加，而GA的含量相對減少，使內(nèi)源激素重新達到一個平衡點，先脫分化促進愈傷組織的形成，進而促進根系的生成。生根率和株高、根長、根數(shù)以及葉片數(shù)不呈絕對的正比關(guān)系，但在適宜的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，較高的生根率對應(yīng)的試管苗生根性狀也相對較優(yōu)。張博等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)生根率和最佳生根性狀沒有對應(yīng)關(guān)系。對于這一現(xiàn)象的發(fā)生，可以在今后的試驗中加強大田扦插繁殖和試管苗微扦插繁殖方面的比較研究，進一步探討2個時期的擴繁在最佳生根性狀和最優(yōu)生根率兩者間的相關(guān)性是否存在差異。

圖6　不同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理下的隴東苜蓿的試管苗葉片數(shù)Fig.6　The tube seedlings of leaf number of Longdong alfalfa under different concentrations of growth regulators treatments

試驗參照以往苜蓿扦插繁殖常用的生長調(diào)節(jié)劑，采用NAA，IBA和ABT 3種外源生長調(diào)節(jié)劑進行單因素處理，3者之間沒有組合處理，在后期的試驗中，預(yù)采用連續(xù)水平的多因子組合試驗，或許能得到更好的生長調(diào)節(jié)劑處理。

研究發(fā)現(xiàn)，適宜的生長調(diào)節(jié)劑可以提高苜蓿試管苗微扦插繁殖效率，在設(shè)置的濃度梯度下，0.2 mg/L NAA對G3紫花苜蓿試管苗生根的促進作用最佳，NAA對試管苗生長的促進作用優(yōu)于ABT和IBA；0.1 mg/L NAA對和田紫花苜蓿試管苗生根的促進作用最佳，NAA、IBA對試管苗生長的促進作用優(yōu)于ABT；0.2 mg/L NAA對隴東紫花苜蓿試管苗生根的促進作用最佳，NAA和IBA對試管苗生長的促進作用優(yōu)于ABT。影響苜蓿試管苗微扦插繁殖效果最好的為萘乙酸(NAA)，吲哚丁酸(IBA)次之，生根粉(ABT)最差，這與張樹振等[2]研究的大田苜蓿扦插繁殖效率的影響結(jié)果一致。另外，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，G3紫花苜蓿在第7 d開始生根，和田和隴東紫花苜蓿在第9 d開始生根，在最終的數(shù)據(jù)統(tǒng)計中，G3紫花苜蓿在各個性狀的表現(xiàn)也比其他2個品種更優(yōu)，推斷該試驗條件可能更適合G3試管苗的微扦插繁殖。

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Effects of growth regulator on micro-cuttage tube seedlings growth of alfalfa

ZHANG Jing,MA Hui-ling

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

Abstract：Taked Gannong No.3 (G3),Hetian (HT),Longdong (LD)alfalfa as the experimental material,the paper studied the effects of different kinds and concentration of growth regulator,including indolebutyric acid (IBA),naphthalene acetic acid (NAA),ABT (ABT) on growth of micro-cuttage tube seedlings of alfalfa.The results showed that under 0.2 mg/LNAA treament,tube seedlings of Gannong no.3 alfalfa had the high number of roots (8),maximum root length (17.5 cm), the highest rooting rate (100%) ,and plant height and leaf number was also significantly higher than that of the control (CK) and other treatment (P<0.05).Under 0.1 mg/LNAAtreatment,the root growth of tube seedlings of Hetian alfalfa was obviously superior to other treatments,the rooting rate was 100%,root number was higher (7)and root length was maximum (29.6 cm),plant height and leaf number was also significantly higher than that of the control (CK) and other treatment s(P<0.05).Under 0.2 mg/LNAA treatment,the root growth of Longdong alfalfa tube seedlings was obviously superior to other treaments,the rooting rate was 100%,the root number was higher (7) and the root length was maximum (10.2 cm),the plant height and leaf number was also significantly higher than that of the control (CK) and other treatments(P<0.05).Therefore, the optimal growth regulator and its concentration for Longdong and Gannong No.3 alfalfa and Hetian alfalfa in micro-cuttage tube seedlings growth was 0.2 mg/L NAA and 0.1 mg/L NAA,repectively.

Key words：growth regulator;alfalfa;tube seedlings;micro-cuttage

中圖分類號：S 541.9

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)02-0076-07

作者簡介：張靜(1991-)，女，甘肅定西人，在讀碩士研究生。

基金項目：“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃“奶牛優(yōu)質(zhì)飼草品種選育與資源高效利用技術(shù)及模式研究”(2012BAD12B02-4)資助

收稿日期：2015-08-12； 修回日期：2015-10-20

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馬暉玲為通訊作者。