經(jīng)導(dǎo)管射頻消融去腎交感神經(jīng)術(shù)對犬腎臟水通道蛋白的影響*

任鵬程， 劉 暢， 邱先迪， 陳偉杰， 殷躍輝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科， 重慶 400010)

經(jīng)導(dǎo)管射頻消融去腎交感神經(jīng)術(shù)對犬腎臟水通道蛋白的影響*

任鵬程， 劉 暢， 邱先迪， 陳偉杰， 殷躍輝△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科， 重慶 400010)

目的： 研究經(jīng)導(dǎo)管射頻消融去腎交感神經(jīng)術(shù)(renal denervation，RDN)對腎臟水通道蛋白(aquapo-rins,AQP)的影響。方法: 選用昆明犬12只，隨機(jī)分為對照組和消融組，每組6只。消融組采用射頻導(dǎo)管消融雙側(cè)腎動(dòng)脈，對照組僅將射頻導(dǎo)管送達(dá)腎動(dòng)脈但不消融。術(shù)后1月，檢測2組犬腎臟去甲腎上腺素濃度、腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)AQP水平,以及血壓的變化。結(jié)果: 術(shù)后1月，消融組腎臟去甲腎上腺素濃度明顯低于對照組(P<0.01)，消融組腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)AQP1～3的表達(dá)均低于對照組。相比術(shù)前，術(shù)后收縮壓和舒張壓也出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論: RDN能降低犬腎臟交感神經(jīng)活性,并抑制腎臟AQP的表達(dá)，這或許是RDN降血壓的機(jī)制之一。

腎交感神經(jīng)； 射頻導(dǎo)管消融； 去甲腎上腺素； 水通道蛋白； 犬

目前盡管高血壓的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的激活和腎性水鈉潴留等機(jī)制參與高血壓的發(fā)病被大家所認(rèn)可。經(jīng)導(dǎo)管射頻消融去腎交感神經(jīng)術(shù)(renal denervation，RDN)通過消融腎動(dòng)脈周圍的腎臟傳入和傳出神經(jīng)，能有效降低全身交感神經(jīng)系統(tǒng)活性和RAS活性，在治療難治性高血壓和改善心功能上取得一定效果[1-2]。但關(guān)于RDN對機(jī)體水鈉潴留影響的實(shí)驗(yàn)研究卻未見報(bào)道。作為腎臟重吸收和調(diào)節(jié)體內(nèi)水平衡的通道，水通道蛋白(aquaporins，AQP)表達(dá)的改變直接影響腎臟對水的重吸收變化，實(shí)驗(yàn)證明，水通道蛋白表達(dá)異常與高血壓、心力衰竭、慢性腎功能不全等多種水平衡紊亂疾病相關(guān)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)擬初步探討RDN對腎臟水通道蛋白的影響，為探索RDN的降壓機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用中國成年昆明犬12只，體重30～35 kg，收縮壓140 mmHg以上。隨機(jī)抽取6只進(jìn)入消融組，行腎動(dòng)脈射頻消融術(shù)；另外6只作為對照組，僅將射頻導(dǎo)管送達(dá)腎動(dòng)脈處而不消融。所有實(shí)驗(yàn)均通過重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格執(zhí)行國家衛(wèi)計(jì)委關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)原則。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2 隨訪評價(jià)及標(biāo)本獲取 術(shù)后定期觀察犬一般情況。術(shù)后1月，通過股動(dòng)脈入路測量血壓,并行雙側(cè)腎動(dòng)脈造影。隨訪完畢，大劑量麻醉劑處死實(shí)驗(yàn)犬，獲取腎臟并立即處理，一部分腎組織分裝于液氮中，另一部分用4%多聚甲醛固定備用。

2.3 高效液相色譜法檢測去甲腎上腺素 將冰凍的腎臟組織塊用5%的高氯酸和1.5 mol/L的醋酸鈉勻漿，然后在4 ℃、10 000×g的條件下離心10 min。采用高效液相色譜(HTTACHI)法檢測腎臟組織去甲腎上腺素濃度。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 從冰凍腎臟上分別取皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分，然后按如下方法檢測水通道蛋白。取100 mg相應(yīng)組織于勻漿器中，加入裂解液和PMSF，在冰上勻漿10 min，然后4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，并吸取上清液，以BCA法測定蛋白濃度，然后加入1/4體積的5×SDS緩沖液，以100 ℃加熱10 min備用。檢測蛋白，腎臟皮質(zhì)蛋白每孔泳道上樣120 μg，腎臟髓質(zhì)蛋白每孔泳道上樣80 μg，然后用5%濃縮膠和10%分離膠行SDS-PAGE。以250 mA恒流條件將蛋白轉(zhuǎn)移至二氟化聚乙烯(polyvinylidence difluoride，PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后I抗(兔抗AQP1、AQP2和AQP3多克隆抗體，Santa Cruz)孵育，4 ℃過夜。用PBST洗滌 10 min ×3次。II抗孵育，37 ℃、1 h。再用PBST洗滌10 min×3次。然后加入Western blot實(shí)驗(yàn)熒光顯影劑顯影，并用Quantity One凝膠系統(tǒng)掃描圖像并分析。

2.5 免疫組化實(shí)驗(yàn) 按照免疫組化檢測試劑盒和濃縮型DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋)說明書方法，腎臟組織石蠟切片脫蠟，洗滌，以3% H2O2室溫下孵育10 min，然后加入枸櫞酸鈉溶液，采用微波修復(fù)10 min，用血清室溫孵育30 min，加I 抗(兔抗AQP1和AQP2多克隆抗體，Santa Cruz)4 ℃孵育過夜，然后加入II 抗37 ℃孵育45 min，以親和素-生物素復(fù)合物室溫孵育60 min，以DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，遂脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。若數(shù)據(jù)滿足方差齊性，組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前后數(shù)據(jù)采用配對樣本t檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎臟組織內(nèi)去甲腎上腺素水平的變化

看著老婆那亂改古訓(xùn)蠻不講理的樣子，我只得說，我不是當(dāng)官了嗎？堂堂的縣農(nóng)業(yè)局副局長，副科級，月薪2358塊。

RDN術(shù)后1月，消融組犬腎臟組織去甲腎上腺素水平明顯低于對照組(P<0.01)。

2 腎臟組織內(nèi)AQP1、AQP2和AQP3 表達(dá)的變化

2.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 RDN術(shù)后1月，消融組腎皮質(zhì)和髓質(zhì)AQP1的表達(dá)均明顯低于對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of RDN on the expression of AQP1 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖1 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測AQP1的表達(dá)

RDN術(shù)后1月，消融組腎髓質(zhì)AQP2表達(dá)低于對照組(P<0.01)，而腎皮質(zhì)AQP2的表達(dá)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of RDN on the expression of AQP2 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測AQP2的表達(dá)

消融組腎髓質(zhì)AQP3的表達(dá)低于對照組(P<0.05)，而腎皮質(zhì)AQP3兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The effect of RDN on the expression of AQP3 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

圖3 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測AQP3的表達(dá)

2.2 免疫組化結(jié)果 AQP1主要分布在腎皮質(zhì)的近端小管和髓質(zhì)的細(xì)段，在皮質(zhì)近端小管，消融組AQP1的表達(dá)低于對照組(P<0.05)；在髓質(zhì)細(xì)段，消融組AQP1的表達(dá)也低于對照組(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.AQP1 immunoreactivity in the renal proximal tubule (A) and the thin limb of Henle’s loop (B) in control group and RDN group (×1 000).

圖4 免疫組化檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)AQP1的表達(dá)

AQP2主要分布于腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的集合管管腔側(cè)細(xì)胞膜，在髓質(zhì)集合管，消融組AQP2的表達(dá)明顯低于對照組(P<0.01)；而在皮質(zhì)集合管，消融組AQP2的表達(dá)與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖5。

Figure 5.AQP2 immunoreactivity in the cortical collecting duct (A) and the medullary collecting duct (B) in control group and RDN group (×1 000).

圖5 免疫組化檢測對照組和實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟皮質(zhì)和髓質(zhì)AQP2的表達(dá)

3 血壓的變化及術(shù)后血管評價(jià)

射頻消融后1月，相比基線血壓值，消融犬收縮壓和舒張壓均出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。在RDN術(shù)前、術(shù)后即刻和術(shù)后4周，行腎動(dòng)脈造影未見動(dòng)脈瘤或血管狹窄等手術(shù)并發(fā)癥，見圖6。

Figure 6.The results of angiography before (A), immediately after (B), and one month after (C) RDN.

圖6 實(shí)驗(yàn)組射頻消融術(shù)前、術(shù)后即刻和術(shù)后1月腎動(dòng)脈造影觀察

討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，是否有效損毀腎臟交感神經(jīng)是RDN發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，而且腎臟組織內(nèi)去甲腎上腺素濃度是評價(jià)腎臟交感神經(jīng)活性變化的經(jīng)典指標(biāo)[6]。Krum等[7]對小豬行RDN，術(shù)后腎臟組織去甲腎上腺素下降幅度超過85%，其對腎臟交感神經(jīng)抑制程度與切斷腎動(dòng)脈再縫合手術(shù)對腎臟交感活性的作用相當(dāng)。本研究通過高效液相色譜法對腎組織內(nèi)去甲腎上腺素濃度進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，消融組犬腎組織去甲腎上腺素水平明顯低于對照組。

本實(shí)驗(yàn)首次觀察到射頻消融腎交感神經(jīng)后腎臟AQP表達(dá)下調(diào)，表明腎交感神經(jīng)的激活對腎臟AQP的表達(dá)有促進(jìn)作用。關(guān)于腎交感神經(jīng)促進(jìn)腎臟AQP表達(dá)的具體機(jī)制目前尚不清楚，但本實(shí)驗(yàn)檢測到RDN術(shù)后腎組織內(nèi)去甲腎上腺素水平明顯下降，且Sonalker等[8]證實(shí)去甲腎上腺素能直接促進(jìn)腎小管AQP的表達(dá)，故可以推測腎交感神經(jīng)激活后，通過調(diào)節(jié)去甲腎上腺素的釋放，發(fā)揮其促進(jìn)腎臟AQP表達(dá)的作用。由于腎交感神經(jīng)還可促進(jìn)RAS的激活，使血管緊張素II(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)表達(dá)上調(diào)，而實(shí)驗(yàn)證明Ang II也具有增強(qiáng)腎臟AQP表達(dá)的作用[9-10]。我們前期的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了RDN術(shù)后血漿Ang II活性明顯下降[11]，所以腎交感神經(jīng)激活后，通過RAS間接促進(jìn)Ang II的合成，或許也是腎臟AQP表達(dá)增加的機(jī)制之一。

腎交感神經(jīng)促進(jìn)腎臟AQP表達(dá)增加，可解釋高血壓、心衰等高交感活性疾病中所觀察到的體液儲(chǔ)留和AQP表達(dá)增加[3-4]。腎交感神經(jīng)激活，通過增強(qiáng)腎小管和集合管AQP對水的重吸收，參與高血壓和心衰等疾病的發(fā)生發(fā)展，此研究結(jié)果為RDN在高血壓、心力衰竭、慢性腎功能不全等更多水儲(chǔ)留疾病的應(yīng)用提供了依據(jù)。RDN降低腎臟交感活性，不但使腎臟AQP表達(dá)下調(diào)，同時(shí)也伴隨血壓的下降，表明AQP表達(dá)下調(diào)也許與RDN的降壓機(jī)制有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)尚發(fā)現(xiàn)，RDN使腎髓質(zhì)AQP1、AQP2和AQP3表達(dá)下降，而腎皮質(zhì)僅AQP1表達(dá)下降，表明腎髓質(zhì)水通道蛋白對腎交感神經(jīng)的調(diào)節(jié)更為敏感。這一結(jié)果與Lee等[12]采用苯酚損毀大鼠腎交感神經(jīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果基本一致，這或許與各水通道蛋白亞型在腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)不同結(jié)構(gòu)的差異性表達(dá)及腎臟皮、髓質(zhì)不同結(jié)構(gòu)間的功能差異有關(guān)[13]，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由于本實(shí)驗(yàn)選擇的動(dòng)物為大型昆明犬，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全代表人體情況。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)只在RDN術(shù)后4周取標(biāo)本檢測指標(biāo)，未能觀察更長期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在今后的實(shí)驗(yàn)中將延長實(shí)驗(yàn)觀察期，為RDN對水通道蛋白的長期調(diào)節(jié)及降壓機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，腎交感神經(jīng)激活通過調(diào)節(jié)去甲腎上腺素和AngII的釋放，對腎臟水通道蛋白的表達(dá)起促進(jìn)作用。RDN能降低犬腎臟交感神經(jīng)活性,并抑制腎臟水通道蛋白的表達(dá)，這或許是RDN降血壓的機(jī)制之一。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

清除老年癡呆癥小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞可以防止神經(jīng)元丟失但并不調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白的病理改變

除了β-淀粉樣蛋白斑和tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)外，神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的另一個(gè)重要病理特征。炎癥在阿爾茨海默氏病的特征性表現(xiàn)為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在淀粉樣蛋白斑周圍聚集，提示活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了作用。在健康成年小鼠，小膠質(zhì)細(xì)胞的生存依賴于集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor 1 receptor, CSF1R)的信號，這種受體的調(diào)節(jié)使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)的通過藥理學(xué)抑制作用可以快速清除幾乎所有的小膠質(zhì)細(xì)胞。為了確定是否阿爾茨海默病大腦中慢性小膠質(zhì)細(xì)胞激活也依賴于CSF1R信號，如果是，那么這些細(xì)胞是如何在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的，Spangenberg等選擇了10月齡的5xfAD小鼠，給予選擇性CSF1R抑制劑處理1個(gè)月，結(jié)果顯示80%的小膠質(zhì)細(xì)胞得以清除。慢性小膠質(zhì)細(xì)胞清除并不改變?chǔ)?淀粉樣蛋白的水平或斑塊沉積，但它確實(shí)降低了5xfAD小鼠樹突的損失和防止了神經(jīng)元的丟失，同時(shí)在整體上減輕了神經(jīng)炎癥。重要的是，行為學(xué)測試表明小鼠的記憶功能得到改善。總的來說，這些研究結(jié)果表明，清除小膠質(zhì)細(xì)胞在防止神經(jīng)元的丟失以及改善5xfAD小鼠記憶障礙方面發(fā)揮了作用，但它并不調(diào)節(jié)或改變?chǔ)?淀粉樣蛋白的病變。

Brain, 2016, 139(Pt 4):1265-1281(范沖竹)

Effect of renal denervation by radiofrequency catheter ablation on expression of aquaporins in dog kidneys

REN Peng-cheng, LIU Chang, QIU Xian-di, CHEN Wei-jie, YIN Yue-hui

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:yinyh63@163.com)

AIM: To investigate the effect of renal denervation (RDN) by radiofrequency catheter ablation on the expression of aquaporins (AQP) in dog kidneys.METHODS: Adult Chinese Kunming dogs (n=12) were randomly divided into RDN group and control group (6 for each group). The dogs in RDN group underwent bilateral RDN using radiofrequency catheter ablation, and radiofrequency catheter was positioned in bilateral renal artery without ablation in control group. The levels of norepinephrine (NE) and AQP1～3 in the renal tissues were detected 1 month after RDN, and blood pressure (BP) measurements were performed at baseline and 1 month after RDN.RESULTS: The level of NE in RDN group was significantly lower than that in control group (P<0.01). The expression of AQP1～3 in the renal cortex and medulla was lower in RDN group than that in control group. RDN also caused a substantial BP reduction (P<0.05). CONCLUSION: RDN substantially decreases the tissue levels of NE and AQP in dog kidneys, and also decreases BP significantly, which might be involved in the mechanism of BP reduction by RDN. Renal sympathetic nerve plays an excitatory role in the regulation of AQP in the kidney.

Renal sympathetic nerve; Radiofrequency catheter ablation; Norepinephrine; Aquaporins; Dogs

1000- 4718(2016)08- 1430- 05

2016- 03- 07

2016- 05- 11

重慶市科委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. cstc2013jcyjA10066)

R454.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.015

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