胰島素聯(lián)合硒協(xié)同抗糖尿病心肌細胞凋亡的作用*

徐天嬌， 劉 勇， 李 萍， 胥曉麗， 曾菊絨

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西 西安 710021； 2延安大學(xué)咸陽醫(yī)院老年病科，陜西 咸陽 712000)

胰島素聯(lián)合硒協(xié)同抗糖尿病心肌細胞凋亡的作用*

徐天嬌1△， 劉 勇2△， 李 萍1， 胥曉麗1， 曾菊絨1

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西 西安 710021；2延安大學(xué)咸陽醫(yī)院老年病科，陜西 咸陽 712000)

目的： 觀察胰島素聯(lián)合硒對糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)大鼠心肌細胞凋亡、Ku70、乙?；疜u70、Bax和細胞色素C(cytochrome C)蛋白水平的影響，初步探討胰島素和硒協(xié)同抗DCM的機制。方法: 將SD大鼠50只隨機分為空白對照組(control組)、糖尿病心肌病模型組(DCM組)、糖尿病心肌病+胰島素(DCM+In)組、糖尿病心肌病+硒(DCM+Se)組和糖尿病心肌病+胰島素+硒(DCM+In+Se)組。流式細胞術(shù)檢測心肌細胞線粒體膜電位；末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling，TUNEL)法觀察心肌細胞凋亡；Western blot 法觀察Ku70、Bax和cytochrome C蛋白水平的變化；免疫共沉淀法檢測Ku70乙?；?。 結(jié)果: 與對照組比較，DCM組大鼠心肌細胞發(fā)生明顯凋亡(P<0.01)，Ku70和乙?；疜u70表達明顯增加(P<0.01)，Bax由胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位同時cytochrome C由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)位(P<0.01)；與DCM+In組或DCM+Se組比較，胰島素聯(lián)合硒明顯抑制心肌細胞凋亡(P<0.05)，下調(diào)Ku70以及乙?；疜u70的表達(P<0.05)并阻止Bax和cytochrome C轉(zhuǎn)位(P<0.05)。結(jié)論: 胰島素和硒可能通過調(diào)控Ku70乙?；鸵种艬ax轉(zhuǎn)位而協(xié)同抗糖尿病心肌細胞凋亡。

胰島素； 硒； 糖尿病心肌??； Ku70； 乙?；?/p>

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病諸多慢性并發(fā)癥中危害性最大，最常見的心血管并發(fā)癥，已成為糖尿病患者心衰及猝死的重要原因。DCM現(xiàn)已被公認是一個獨立的、特異的心肌疾病，其早期臨床特征是左心室舒張功能障礙，晚期以收縮功能障礙為主，可誘發(fā)心力衰竭、心源性休克和猝死。

高血糖及其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在DCM的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，其可促使心肌細胞凋亡[1-3]。研究表明，氧化應(yīng)激刺激可顯著升高Ku70及乙?；疜u70表達，并促使Bax的轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)細胞凋亡，當心肌細胞凋亡達到一定數(shù)量就會導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭[4-6]。

我們前期研究已經(jīng)證明，胰島素和硒聯(lián)合應(yīng)用在降低血糖、糖化血紅蛋白以及血脂方面具有協(xié)同作用[7]；胰島素和硒聯(lián)合能夠顯著改善DCM大鼠心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)并減少心肌膠原纖維堆積；顯著升高左室收縮末壓、左室舒張末壓、左室內(nèi)壓最大下降速率，同時降低左室內(nèi)壓最大上升速率[8]。但目前尚不清楚胰島素與硒聯(lián)合協(xié)同抗DCM的機制，故此，本研究通過觀察藥物對心肌細胞凋亡、K70/乙酰化Ku70的蛋白水平、Bax和細胞色素C(cytochrome C)轉(zhuǎn)位的影響，初步探討胰島素聯(lián)合硒協(xié)同抗DCM的機制，以期為DCM的研究提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

選取體重180～230 g的SD大鼠，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，房間溫度保持在25 ℃左右，濕度在50%左右，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和亞硒酸鈉購于Sigma；中效胰島素由丹麥諾和靈公司生產(chǎn)；anti-Ku70、anti-Bax、anti-cytochrome C、protein A/G beads、anti-β-actin等均購自Santa Cruz；anti-COX4購于Gene Tex。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組 用STZ(55 mg/kg)一次性腹腔注射，1周后取尾靜脈血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++～++++者原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)6周后(即第8周后)心臟超聲診斷儀評價大鼠心功能。M型超聲模式下測定左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)，儀器自動計算左室射血分數(shù)(ejection fraction，EF)和左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)以評價心臟收縮功能；組織多普勒模式下測定舒張早期二尖瓣環(huán)峰值運動速度(early diastolic mitral annular velocity，Em)和舒張晚期二尖瓣環(huán)峰值運動速度(end diastolic mitral annular velocity，Am)并計算Em/Am以評價心臟舒張功能。凡EF、FS和Em/Am明顯下降(Em/Am<1)，且血糖仍穩(wěn)定在16.7 mmol/L以上者納入糖尿病心肌病大鼠模型。

將大鼠隨機分為5組，每組10只：空白對照(control)組：自由進水和飲食； 糖尿病心肌病模型(DCM)組：自由進水和飲食； 糖尿病心肌病+胰島素(DCM+In)組：按1 U·kg-1·d-1皮下注射胰島素；糖尿病心肌病+硒(DCM+Se)組：按180 μg·kg-1·d-1管飼亞硒酸鈉；糖尿病心肌病+胰島素+硒(DCM+In+Se)組：按1 U·kg-1·d-1皮下注射胰島素同時管飼180 μg·kg-1·d-1亞硒酸鈉。每組均連續(xù)給藥6周。

2.2 流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測線粒體膜電位 取適量心肌組織制成單細胞懸液，將100 μL細胞懸液加入5 mL的流式測定管中，在測定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對照管不加，輕輕混勻。將測定管和對照管置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管中，上機檢測。流式細胞儀激發(fā)波為488 nm，紅色熒光的最大發(fā)射波長為580/590 nm，綠色熒光的最大發(fā)射波長為510/527 nm，以紅/綠熒光強度比值代表細胞線粒體膜電位。

2.3 末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling， TUNEL)檢測細胞凋亡 心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。切片在二甲苯中脫蠟 5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。滴加適量不含DNase的蛋白酶K，37 ℃作用20 min，PBS 洗滌3次。滴加 TUNEL 反應(yīng)混合液于濕盒中，37 ℃反應(yīng) 1 h，PBS洗3 min 3次；擦去切片多余的液體，加適量DAB 溶液至切片上，室溫下放置 5 min： 除去 DAB 液體，蒸餾水洗3次。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水反藍 10 min。逐級脫水，透明，中性樹脂封片。在光鏡下觀察，以細胞核呈棕黃色為凋亡陽性細胞。在顯微鏡下(×400)計數(shù)凋亡細胞和總細胞數(shù)，并計數(shù)凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=凋亡細胞/總細胞數(shù)×100%。

2.4 Western blot 法檢測Ku70、胞漿/線粒體Bax和胞漿/線粒體cytochrome C的蛋白水平 使用組織線粒體分離試劑盒提取細胞漿蛋白和線粒體蛋白，嚴格按照步驟操作把新鮮的心肌組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細小的組織碎片；加入預(yù)冷的PBS，冰浴3 min。600×g離心10～20 s，沉淀組織樣品，棄上清。再加入預(yù)冷的胰酶消化液，冰浴20 min。600×g離心10～20 s，沉淀組織樣品，棄上清。加入相應(yīng)線粒體分離試劑，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。600×g離心10～20 s，沉淀組織樣品，棄上清。加入預(yù)冷的添加了PMSF的線粒體分離試劑，在冰浴上進行勻漿，勻漿20～30次。600×g、4 ℃離心5 min。小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11 000×g、4 ℃離心10 min。小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。所得沉淀即為分離得到的線粒體。隨后把收集的上清12 000×g、4 ℃離心10 min。取上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。

取各組樣品50 μg蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；加適當比例稀釋的第 I 抗體，4 ℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的II抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應(yīng)，即刻與X光片曝光，目的條帶使用分析儀進行分析。

2.5 免疫共沉淀(co-immunoprecition, Co-IP)檢測心肌細胞中乙酰化Ku70的蛋白水平 取經(jīng)提取的總蛋白300 μg加入1.5 mL預(yù)先放置了裂解液的離心管，加入5 μg的IP抗體， 4 ℃孵育2 h；加入30 μL protein A/G beads，4 ℃翻轉(zhuǎn)1 h；4 ℃下離心5 min，棄去上清液；Protein A/G beads用裂解液(1 mL)洗3～4次，離心同上；加入15 μL 2×電泳上樣緩沖液，煮3～5 min。離心，取上清液；將上清液50 μg 進行SDS-PAGE分離蛋白。并將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h；加入適當稀釋的 I 抗后于4 ℃條件下孵育過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的 II 抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應(yīng)，即刻與X光片曝光。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較應(yīng)用Tukey HSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胰島素和硒協(xié)同抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與control組比較，DCM組線粒體膜電位顯著性降低(P<0.01)；與DCM組比較，DCM+In組、DCM+Se組和DCM+In+Se組線粒體膜電位明顯增加(P<0.01)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組線粒體膜電位明顯增加(P<0.01),見圖1。

TUNEL法檢測凋亡心肌細胞核呈棕黃色染色，control組大鼠心肌細胞核極少有棕黃染色(AI約為5%)；DCM組大鼠心肌細胞中出現(xiàn)大量棕黃染色(AI為 30%～40%)，與control組比較差異存在統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)； DCM+In組(AI約為24%左右)和DCM+In+Se組(AI約為15%左右)心肌細胞棕黃色顆粒均明顯減少，與DCM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，而DCM+Se組(AI約為28%左右)與DCM組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組心肌細胞中棕黃色染色顯著性減少(P<0.05),見圖 2。以上結(jié)果說明胰島素和硒能夠協(xié)同抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡。

2 胰島素和硒能夠顯著抑制Ku70的表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，與control組比較，DCM組Ku70表達顯著增加(P<0.01)；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組Ku70表達明顯減少(P<0.05)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組Ku70水平顯著降低(P<0.05),見圖 3。這些結(jié)果說明，胰島素和硒能夠協(xié)同降低DCM大鼠心肌組織中Ku70的表達。

3 胰島素和硒能夠顯著抑制DCM大鼠心肌細胞Ku70乙?；?/p>

IP-Western blot 實驗結(jié)果顯示，與control組比較，DCM組乙酰化Ku70顯著增加；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組乙?；疜u70明顯減少；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組乙酰化Ku70水平顯著減少(圖4)。這些結(jié)果說明，胰島素和硒能夠協(xié)同抑制DCM大鼠心肌組織中Ku70乙?；?。

Figure 1.The changes of mitochondria membrane potential (MMP) in different groups. Mean±SD.n=3 .**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsDCM;▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

圖1 各實驗組心肌細胞線粒體膜電位變化

Figure 2.The cell apoptosis in different groups. Mean±SD.n= 3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

圖2 各實驗組心肌細胞凋亡的變化

Figure 3.Ku70 levels in different groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05vsDCM+In;#P<0.05vsDCM+Se.

圖3 各實驗組心肌細胞中Ku70的表達

Figure 4.The protein levels of acetylated Ku70 in different groups. The protein lysates were immunoprecipitated with anti-acetylated lysine antibody. The resulting protein complexes were then immunoblotted for determining Ku70. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsDCM;▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

圖4 各實驗組心肌細胞中乙?；疜u70蛋白的水平

4 胰島素和硒顯著抑制Bax和cytochrome C的轉(zhuǎn)位

Western blot實驗結(jié)果顯示，與control組比較，DCM組胞漿中Bax明顯減少而線粒體中明顯增加(P<0.01)，cytochrome C則是胞漿中明顯增加而線粒體中明顯減少(P<0.01)；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組Bax胞漿中明顯增加而線粒體中明顯減少(P<0.01)，cytochrome C在胞漿中明顯減少而在線粒體中明顯增加(P<0.01)，DCM+Se組僅線粒體中cytochrome C表達量明顯增加(P<0.05)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組的Bax在胞漿中明顯增加而在線粒體中明顯減少(P<0.05)，cytochrome C在胞漿中明顯減少而在線粒體中明顯增加(P<0.05),見圖 5。這些說明，糖尿病心肌病時心肌組織中Bax和cytochrome C發(fā)生明顯轉(zhuǎn)位，而胰島素聯(lián)合硒則能協(xié)同抑制Bax和cytochrome C的轉(zhuǎn)位。

討 論

糖尿病是一種威脅全人類健康的疾病。國際糖尿病聯(lián)合會報道，預(yù)計到2025年全世界糖尿病患者將達到3.33億。我國截止2010年糖尿病患者已有9240萬，而糖尿病前期的患者則高達1.48億，防控形勢十分嚴峻[9]。隨著糖尿病發(fā)病率增高及病程的延長， DCM已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。DCM 的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，涉及多方面因素。

高血糖是 DCM 的關(guān)鍵始動因素，在 DCM 的發(fā)病機制中起著核心作用。長期高血糖能直接引起正常心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能異常，導(dǎo)致糖尿病性心肌病變，促使心肌細胞凋亡增加。另外，高血糖還可以顯著增加氧化應(yīng)激水平[10-11]，而氧化應(yīng)激又可引起基因表達異常，改變信號傳導(dǎo)，引起心肌細胞凋亡并最終影響心功能[1-2, 4, 12-14]。因此，如何早期使用藥物在降低血糖的同時改善氧化應(yīng)激水平對于改善心臟重構(gòu)及舒縮功能異常，防止心肌肥大及心功能不全的發(fā)生顯得尤為重要。

目前在DCM治療上尚沒有具體的特效治療方案，主要是進行降糖和相應(yīng)的對癥治療。胰島素是控制高血糖的有效方法之一，在糖尿病及其并發(fā)癥治療中起著不可替代的作用，但僅對糖尿病急性并發(fā)癥有效，而對糖尿病慢性并發(fā)癥療效欠佳。硒作為哺乳動物和人類必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的主要活性成分，具有顯著的抗氧化性，另一方面其還具有類胰島素樣作用。故此，我們提出將胰島素與硒聯(lián)合用于DCM。結(jié)果顯示，DCM大鼠心肌細胞線粒體膜電位顯著性下降并且細胞發(fā)生明顯凋亡；胰島素和硒聯(lián)合應(yīng)用后能夠顯著升高DCM大鼠心肌細胞線粒體膜電位，抑制心肌細胞凋亡，這說明兩藥聯(lián)合在抑制心肌細胞凋亡方面明顯優(yōu)于胰島素或硒治療。

Figure 5.The protein levels of Bax and cytochrome C in different groups. A: Bax level in the cytoplasm; B: Bax level in the mitochondria; C: cytochrome C level in the cytoplasm; D: cytochrome C level in the mitochondria. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

圖5 各組心肌組織Bax和cytochrome C蛋白水平的變化

Ku70是一種在細胞漿和細胞核中均有分布的蛋白，胞漿中的Ku70蛋白與前凋亡蛋白Bax結(jié)合，抑制Bax由細胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位而發(fā)揮抗凋亡作用[15]。當Ku70被乙?；罂舍尫懦鼋Y(jié)合的Bax，促進Bax從胞漿進入線粒體而cytochrome C則由線粒體進入胞漿，從而啟動細胞的線粒體凋亡途徑。因此，抑制Ku70乙?；且种萍毎蛲龅闹匾侄沃?。鑒于此，本實驗進一步研究胰島素與硒對Ku70、乙?；疜u70表達以及Bax和cytochrome C轉(zhuǎn)位的影響。實驗發(fā)現(xiàn)DCM組Ku70/乙?；疜u70表達顯著性增加，并且Bax由細胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位而cytochrome C則由線粒體向細胞漿轉(zhuǎn)位，這說明DCM時心肌細胞胞漿中的Ku70被乙?；蟠偈沽薆ax由胞漿向線粒體的轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡并最終會影響心功能；DCM大鼠經(jīng)胰島素治療后只能部分降低Ku70、乙?；疜u70的蛋白水平和阻止Bax及cytochrome C的轉(zhuǎn)位，而胰島素和硒聯(lián)合治療后則顯著性降低Ku70/乙?；疜u70水平并能夠顯著逆轉(zhuǎn)Bax及cytochrome C轉(zhuǎn)位，這說明聯(lián)合用藥在糾正Ku70/乙酰化Ku70水平、逆轉(zhuǎn)Bax及cytochrome C轉(zhuǎn)位方面明顯優(yōu)于單獨用藥組。

基于以上研究，我們認為胰島素聯(lián)合硒可能通過影響Ku70乙酰化和阻止Bax轉(zhuǎn)位來抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮協(xié)同抗DCM效應(yīng)。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Synergistic effect of insulin and selenium in combination on inhibiting myocardial apoptosis in rats with diabetic cardiomyopathy

XU Tian-jiao1, LIU Yong2, LI Ping1, XU Xiao-li1, ZENG Ju-rong1

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofGeriatrics,XianyangHospitalofYanAnUniversity,Xianyang712000,China.E-mail:xtj1118@163.com; 15991883311@163.com)

AIM: To investigate the effect of insulin and selenium in combination on the apoptosis and the expression of Ku70, acetylated Ku70, Bax and cytochrome C in myocardial cells of the rats with diabetic cardiomyopathy(DCM), and to explore the mechanism of insulin and selenium in their synergistic anti-DCM effect. METHODS: SD rats (n=50) were randomly grouped into control, DCM, DCM with insulin treatment (DCM+In) group, DCM with selenium treatment (DCM+Se) group, and DCM with insulin and selenium combination treatment (DCM+In+Se) group. Mitochondrial membrane potential (MMP) was measured by flow cytometry. The cell apoptosis was observed by terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL). The levels of Ku70, Bax and cytochrome C were examined by Western blot. The acetylation status of Ku70 was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS: The rats in DCM group showed marked cell apoptosis compared with the control rats. The levels of Ku70 and acetylated Ku70 declined significantly compared with control group. Bax significantly translocated from cytoplasm into mitochondria and cytochrome C translocated from mitochondria into cytoplasm compared with control group. Compared with DCM+In group or DCM+Se group, insulin and selenium in combination significantly inhibited the apoptosis, down-regulated Ku70 and acetylated Ku70 levels, and prevented Bax and cytochrome C translocation.CONCLUSION: Insulin and selenium synergistically inhibits myocardial apoptosis by regulating Ku70 acetylation and inhibiting Bax translocation.

Insulin; Selenium; Diabetic cardiomyopathy; Ku70; Acetylation

1000- 4718(2016)08- 1357- 07

2016- 01- 07

2016- 06- 13

陜西省教育廳自然科學(xué)項目(No. 15JK1633)；西安醫(yī)學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)經(jīng)費資助(2016年～2019年)

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.003

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