極性蛋白Par3在小鼠胚胎著床子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

陳明明，徐望明，肖卓妮，解美婷

·論著·

極性蛋白Par3在小鼠胚胎著床子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

陳明明，徐望明，肖卓妮，解美婷

【摘要】目的：探討極性蛋白Par3在不同小鼠模型子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平及其在小鼠胚胎著床過(guò)程中的作用。方法：建造妊娠1～8 d（早孕組）、假孕1～5 d（假孕組）、卵巢切除后類固醇激素注射（類固醇激素處理組）小鼠模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各種模型中小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮中Par3的表達(dá)情況，并使用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果：早孕組妊娠1～4 d小鼠內(nèi)膜腔上皮中持續(xù)表達(dá)Par3并于妊娠4 d達(dá)高峰，于妊娠5 d明顯減弱，妊娠6～8 d圍繞胚胎初級(jí)蛻膜區(qū)域陰性表達(dá)并于次級(jí)蛻膜區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)；假孕組Par3表達(dá)趨勢(shì)與早孕組類似，趨勢(shì)變化幅度較早孕組??；類固醇激素處理組中，注射雌二醇（E2）組、孕酮（P4）組以及同時(shí)注射E2+P4組的Par3表達(dá)水平均明顯低于注射芝麻油對(duì)照組。結(jié)論：雌、孕激素可下調(diào)Par3表達(dá)，Par3表達(dá)水平下降引起子宮內(nèi)膜腔上皮極性短暫下調(diào)有利于胚胎著床。

【關(guān)鍵詞】胚胎植入；子宮內(nèi)膜；細(xì)胞極性；GTP結(jié)合蛋白質(zhì)類；小鼠

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：17-20）

近年來(lái)多項(xiàng)研究致力于監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)及伴隨子宮內(nèi)膜容受性發(fā)生變化的相關(guān)因子表達(dá)[1]，以期能夠針對(duì)性地改善子宮內(nèi)膜容受性，并提高輔助生殖技術(shù)的胚胎著床率。多項(xiàng)研究表明緊密連接（tight junctions，TJs）蛋白參與子宮內(nèi)膜容受性的建立，并參與早期胚胎植入與發(fā)育[2-4]。而對(duì)腎、肺等其他人體組織的研究發(fā)現(xiàn)，Par3（partitioning defective-3）的表達(dá)與TJs的形成密切相關(guān)[5-6]。在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中，Par3是調(diào)節(jié)細(xì)胞極性和TJs功能的關(guān)鍵蛋白。但在子宮內(nèi)膜腔上皮中，Par3是否同樣發(fā)揮這種作用并通過(guò)這一作用影響胚胎著床，尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析Par3蛋白在各類小鼠動(dòng)物模型子宮腔上皮中的表達(dá)水平，從而了解Par3在小鼠胚胎著床中的作用機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年近交昆明種小白鼠，SPF級(jí)，6～12周齡，25～35 g，由武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22～24℃，12 h光照/12 h黑暗（07∶00/19∶00），可自由取食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑17β-雌二醇（17β-E2，美國(guó)Sigma公司），孕酮（P4，美國(guó)Sigma公司），Par3抗體（兔抗鼠多克隆抗體，英國(guó)ABCAM公司），SP免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒[德國(guó)DAKO（K5007）公司]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建

1.3.1.1早孕模型每日15∶00～17∶00雌、雄小鼠以2∶1比例合籠，次日晨9∶00檢查見(jiàn)陰栓為妊娠第1天，記為1 d，之后每天上午9∶00以頸椎脫臼法處死收集早孕1～8 d小鼠子宮，每天3只。另取動(dòng)情期非妊娠小鼠子宮作為對(duì)照。

1.3.1.2假孕模型雄性小鼠經(jīng)雙側(cè)輸精管結(jié)扎手術(shù)后2周與雌性小鼠以1∶1比例合籠，檢查陰栓后確認(rèn)該雌性小鼠未懷孕方可認(rèn)定雄性小鼠結(jié)扎手術(shù)成功。結(jié)扎成功雄性小鼠與雌性小鼠以1∶2比例合籠。次晨9∶00檢查見(jiàn)雌鼠陰栓為假孕（早孕和假孕均有陰栓，區(qū)別在于假孕組內(nèi)陰栓無(wú)精子）第1天，記為假孕1 d。之后每天上午9∶00以頸椎脫臼法處死收集假孕1～5 d小鼠子宮，每天3只。另取動(dòng)情期非妊娠小鼠子宮作為對(duì)照。

1.3.1.3類固醇激素處理模型未經(jīng)合籠雌性小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后2周隨機(jī)分為4組，每組3只。注射類固醇激素后分為芝麻油對(duì)照組（0.1 mL/只）、E2組（1 mg/L，0.1 mL/只）、P4組[10 g/L，0.1 mL/只）以及E2+P4共同處理組。注射24 h后取材。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色新鮮小鼠子宮取出后4%碳酸二乙酯（DEPC）水固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片厚約4 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫、10%山羊血清孵育，滴加Par3一抗工作液（1∶200），4℃過(guò)夜次日復(fù)溫，50 μL二抗（Dako Denmark A/S公司），室溫孵育。滴加50 μL新鮮配置的DAB鏡下觀察。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片鏡檢。每組均設(shè)陰性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗進(jìn)行孵育。

1.3.3圖像分析每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野在400倍鏡下觀察，采用Nikon顯微成像系統(tǒng)拍攝圖片。采用Image-Pro Plus （IPP）圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性部位光密度總和（IOD sum）以及該部位區(qū)域總面積（Area sum），使用平均光密度（MOD= IOD sum/Area sum）作為Par3相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。半定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，早孕及假孕模型小鼠組間比較采用單因素方差分析，類固醇處理模型小鼠組間比較采用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1早孕模型小鼠子宮腔上皮Par3表達(dá)情況妊娠1～4 d模型小鼠的Par3表達(dá)量較對(duì)照組（非妊娠小鼠）上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。妊娠1～3 d模型小鼠的Par3表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。妊娠4 d的Par3表達(dá)量較妊娠1～3 d升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；妊娠5 d模型小鼠較妊娠4d模型小鼠明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。免疫組織化學(xué)染色顯示，妊娠1～5 d子宮內(nèi)膜均可見(jiàn)Par3表達(dá)，且于4 d時(shí)達(dá)高峰并于5 d時(shí)迅速下調(diào)，妊娠6～8 d模型小鼠胚胎周圍次級(jí)蛻膜區(qū)域Par3幾乎陰性表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1　Par3在早孕模型小鼠子宮內(nèi)膜的相對(duì)表達(dá)量

圖2　Par3在早孕模型小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)

2.2假孕模型小鼠子宮腔上皮Par3表達(dá)情況Par3表達(dá)量隨假孕時(shí)間推移逐漸升高，于假孕3 d達(dá)到高峰后逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。假孕2 d與假孕4 d模型小鼠的Par3表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。免疫組織化學(xué)染色顯示，假孕1～5 d均可見(jiàn)Par3表達(dá)且于3 d達(dá)高峰后逐漸下調(diào)。見(jiàn)圖4。

圖3　Par3在假孕模型小鼠子宮內(nèi)膜的相對(duì)表達(dá)量

圖4　Par3在假孕模型小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)（SP×400）

2.3經(jīng)類固醇處理模型小鼠子宮腔上皮Par3表達(dá)情況與對(duì)照組比較，E2組、P4組以及E2+P4組的Par3表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)圖5。免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜可見(jiàn)Par3陽(yáng)性表達(dá)，E2組、P4組以及E2+P4組小鼠子宮內(nèi)膜Par3表達(dá)較弱。見(jiàn)圖6。

圖5　Par3在經(jīng)類固醇處理模型小鼠子宮內(nèi)膜的相對(duì)表達(dá)量

圖6　Par3在經(jīng)類固醇處理模型小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)（SP×400）

3　討論

Par基因（partitioning defective gene）首次由Kemphues等[7]在線蟲（C.elegans）的受精卵中發(fā)現(xiàn)，而后Par蛋白作為細(xì)胞與組織極性的建立者開始受到關(guān)注。Par3分布在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，是一類多結(jié)構(gòu)域功能蛋白。具有Par3A和Par3B兩種基因，它們的蛋白產(chǎn)物均具有3個(gè)盤狀同源區(qū)域（PDZ結(jié)構(gòu)域），可以與Par6以及非典型性蛋白激酶C（aPKC）相結(jié)合。由Par3、Par6、aPKC和小分子GTP酶（Cdc42和Rac1）組成的復(fù)合體稱為Par極性復(fù)合體[8]。Par極性蛋白復(fù)合體的沉積引導(dǎo)細(xì)胞頂?shù)讟O性的發(fā)生[9-10]。

哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞是高度極化的細(xì)胞，其極性的一個(gè)重要體現(xiàn)就是在相鄰細(xì)胞之間形成TJs，這也是極性破壞的靶點(diǎn)。TJs主要由形成細(xì)胞間接觸的TJs蛋白ZO-1、跨膜蛋白分子Claudin、穿膜蛋白Occludin以及連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）共同組成，是上皮細(xì)胞最極性化的結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)上皮通透性以及區(qū)分細(xì)胞的頂-基底區(qū)域[11]。其中JAMs是屬于免疫球蛋白亞家族成員，在TJs處分布豐富。其與TJs形成的關(guān)系密切，可通過(guò)其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和TJs相關(guān)蛋白直接結(jié)合，包括PAR3、ZO-1、AF-6和MUPP1。JAMs分為JAM-1、JAM-2、JAM-3三種亞型，其中JAM-1可通過(guò)其羧基末端的PDZ結(jié)構(gòu)域和PAR3的第一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域作用，使Par3在TJs處富集[12]。

Chen等[5]研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中Par3表達(dá)異常可明顯破壞TJs的形成。胡燕軍[2]通過(guò)培養(yǎng)代表子宮內(nèi)膜非容受態(tài)上皮細(xì)胞HEC-1A發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TJs蛋白Occludin后能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與胚泡的黏附。HEC-1A上皮細(xì)胞存在功能性的TJs，提示Occludin下調(diào)參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。本研究通過(guò)各小鼠模型以探索Par3是否可能通過(guò)影響TJs作用影響胚胎著床。

胚胎著床過(guò)程中，子宮內(nèi)膜容受性受到嚴(yán)格調(diào)控。在早孕3 d或假孕4 d小鼠中，子宮處于預(yù)備接受態(tài)，繼而在5 d后轉(zhuǎn)向不應(yīng)態(tài)形成初級(jí)蛻膜[13]。本研究中，早孕及假孕模型小鼠1～4 d子宮內(nèi)膜腔上皮均可見(jiàn)Par3持續(xù)表達(dá)，假孕模型小鼠Par3表達(dá)量變化趨勢(shì)與早孕模型小鼠類似但變化幅度較早孕模型小鼠小，提示Par3表達(dá)為非胚胎依賴性。妊娠需要穩(wěn)定的環(huán)境維持胚胎發(fā)育，Par3作為極性因子表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮有利于形成一道胚胎保護(hù)屏障。而在早孕5 d可見(jiàn)Par3表達(dá)明顯下調(diào)，腔上皮極性減弱，可能與有利于胚胎侵入有關(guān)。早孕6～8 d子宮內(nèi)膜腔上皮退化，形成初級(jí)蛻膜區(qū)，Par3于此區(qū)域表達(dá)微弱并在次級(jí)蛻膜區(qū)表達(dá)較強(qiáng)，可能有利于胚胎在初級(jí)蛻膜區(qū)侵入性生長(zhǎng)，并同時(shí)于次級(jí)蛻膜區(qū)形成新的保護(hù)性屏障。

早孕1 d，小鼠子宮腔上皮細(xì)胞在排卵前E2的作用下增殖。早孕3 d小鼠卵巢黃體組織分泌P4，促進(jìn)子宮基質(zhì)細(xì)胞增殖并抑制腔上皮細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。本研究中，小鼠切除雙側(cè)卵巢14 d后分別行E2、P4以及E2和P4同時(shí)注射，Par3表達(dá)量明顯下調(diào)。提示雌、孕激素分別作用以及雌、孕激素協(xié)同作用均可下調(diào)Par3表達(dá)量，減弱上皮細(xì)胞極性，從而利于胚胎侵入性著床。

總之，Par3于早孕1～4 d持續(xù)表達(dá)，表明子宮內(nèi)膜腔上皮極性的維持形成對(duì)胚胎有保護(hù)性屏障作用。早孕4 d時(shí)達(dá)高峰隨即于5 d時(shí)迅速下調(diào)，可能在小鼠胚胎著床過(guò)程中腔上皮極性短暫下調(diào)有利于胚胎著床。雌、孕激素可能對(duì)Par3起下調(diào)作用。Par3參與小鼠胚胎著床過(guò)程，但是否通過(guò)改變TJs進(jìn)行調(diào)控還需要進(jìn)一步研究。深入了解Par3及TJs在人類妊娠中的調(diào)控機(jī)制，可成為不孕不育治療新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]隋曉倩，于德欽，張冬梅.子宮內(nèi)膜容受性各相關(guān)標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].生殖與避孕，2015，35（3）：185-190.

[2]胡燕軍.人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接及其蛋白在胚胎著床中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D].杭州：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2010.

[3]趙海君，張園，崔毓桂.緊密連接在妊娠生理與病理生理中的作用[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2013，40（5）：416-419.

[4]朱秋遠(yuǎn).脂肪酸結(jié)合蛋白4對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響[D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

[5]Chen X，Macara IG. Par-3 controls tight junction assembly through the Rac exchange factor Tiam1[J]. Nat Cell Biol，2005，7（3）：262-269.

[6]許飛來(lái). Occludin調(diào)控細(xì)胞遷移極性的建立及Par3在肺癌中的功能研究[D].上海：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，2010.

[7]Kemphues KJ，Priess JR，Morton DG，et al. Identification of genes required for cytoplasmic localization in early C.elegans embryos[J]. Cell，1988，52（3）：311-320.

[8]Zhou Y. Cortical development and asymmetric cell divisions [J]. Front Biol，2012，7（4）：297-306.

[9]Wang Q，Margolis B. Apical junctional complexes and cell polarity [J]. Kidney Int，2007，72（12）：1448-1458.

[10]Durgan J，Kaji N，Jin D，et al. Par6B and atypical PKC regulate mitotic spindle orientation during epithelial morphogenesis [J]. J Biol Chem，2011，286（14）：12461-12474.

[11]Chen X，Macara IG. Par-3 mediates the inhibition of LIM kinase 2 to regulate cofilin phosphorylation and tight junction assembly[J]. J Cell Biol，2006，172（5）：671-678.

[12]Suzuki A，Ishiyama C，Hashiba K，et al. aPKC kinase activity is required for the asymmetric differentiation of the premature junctional complex during epithelial cell polarization[J]. J Cell Sci，2002，115（Pt 18）：3565-3573.

[13]Tan J，Paria BC，Dey SK，et al. Differential uterine expression of estrogen and progesterone receptors correlates with uterine preparation for implantation and decidualization in the mouse[J]. Endocrinology，1999，140（11）：5310-5321.

[14]Huet -Hudson YM，Andrews GK，Dey SK. Cell type -specific localization of c-myc protein in the mouse uterus：modulation by steroid hormones and analysis of the periimplantation period [J]. Endocrinology，1989，125（3）：1683-1690.

[本文編輯王昕]

Expression of Polarity Protein Par3 in Mouse Endometrium during Embryo Implantation

CHEN Ming-

ming，XU Wang-ming，XIAO Zhuo-ni，XIE Mei-ting.
Department of Obstetrics and Gynecology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China.
Corresponding author：XU Wang-ming，E-mail：wmxu609@msn.com

【Abstract】Objective：To analyse the expression of polarity protein Par3, and its possible effects, in the mouse endometrium during embryo implantation. Methods：The mice models of early pregnancy（1-8 days of pregnancy）, pseudo-pregnancy and the steroid treatment（steroid injection in the emasculated mice）were used in this study. The expression of Par3 in uterus were tested by immunohistochemistry and analyzed by Image-Pro Plus system. Results：Expression of Par3 was increased in the uterine luminal epithelium on 1 to 4 days of early pregnancy, and then lowered on the day 5 of pregnancy. Interestingly, the positive expression of Par3 was found in the secondary decidual zone on the day 6 to 8 of pregnancy, while the negative expression in the primary decidual zone. Pseudo-pregnant models have a similar expression pattern as the early pregnant models, with low expression levels. In ovariectomized mice, both E2and P4treatment, or the combined treatment, could downregulate the expression of Par3 in the luminal epithelium. Conclusions：The expression of Par3 in the uterine luminal epithelium of early pregnancy can be briefly down-regulated by E2and P4, which is benefit for embryo implantation.

【Keywords】Embryo implantation；Endometrium；Cell polarity；GTP-binding proteins；Mice

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81100418，81471455）

作者單位：430060武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科

通信作者：徐望明，E-mail：wmxu609@msn.com

收稿日期：（2015-09-06）