PCNA、Survivin蛋白在人絨癌細胞株BeWo合體化過程中表達變化的研究

易莉莎，林耀華，張國正

·論著·

PCNA、Survivin蛋白在人絨癌細胞株BeWo合體化過程中表達變化的研究

易莉莎，林耀華，張國正

【摘要】目的：通過檢測人絨癌細胞株BeWo合體化過程中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、生存素（Survivin）蛋白表達的變化，探討滋養(yǎng)細胞合體化后增殖性的變化，為惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤，尤其是耐藥惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤的臨床治療提供新的思路和方法。方法：利用毛喉素（forskolin）誘導(dǎo)BeWo細胞株融合；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測促融素（Syncytin）在forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中的表達；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測PCNA、Survivin蛋白在forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中的表達；應(yīng)用噻唑藍比色分析實驗（MTT）法檢測forskolin作用不同時間的絨癌細胞株BeWo的增殖能力。結(jié)果：①forskolin作用后的BeWo細胞株Syncytin基因的表達增強，且隨著forskolin作用時間的延長，Syncytin的表達更強，于48 h達到高峰。②forskolin作用后的BeWo細胞株P(guān)CNA、Survivin蛋白的表達降低。③forskolin作用后的BeWo細胞株的增殖能力下降，且不同作用時間的差異有統(tǒng)計學意義；forskolin作用的時間越長，BeWo細胞株增殖能力下降越明顯。結(jié)論：人絨癌細胞株BeWo合體化后PCNA、Survivin蛋白的表達降低，說明人絨癌細胞株BeWo合體化后增殖性降低，推測誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞合體化可能對臨床治療惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤具有一定作用。

【關(guān)鍵詞】增殖細胞核抗原；微管相關(guān)蛋白質(zhì)類；福司柯林；細胞融合

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：9-12）

妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic tumor，GTT）是由妊娠滋養(yǎng)細胞異常發(fā)育及增殖所致的與妊娠相關(guān)的腫瘤。中國位于該病的高發(fā)地區(qū)，葡萄胎在中國的發(fā)病率為0.8‰～1.0‰，該病已經(jīng)成為嚴重威脅中國育齡婦女生命健康的惡性疾病之一[1]。GTT對化療十分敏感，早期GTT患者治愈率高達90%以上，但晚期及耐藥患者的治愈率僅為30%～40%，故解決GTT耐藥復(fù)發(fā)問題已經(jīng)成為該病的研究重點[2]。細胞融合是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。細胞滋養(yǎng)細胞通過增殖、分化，最終融合形成合體滋養(yǎng)細胞。細胞滋養(yǎng)細胞合體化過程中細胞滋養(yǎng)細胞分化到一定階段出現(xiàn)可逆的凋亡早期事件。本研究基于以上理論，意在通過研究人絨癌細胞株BeWo合體化后增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及生存素（Survivin）蛋白的表達變化，初步探討滋養(yǎng)細胞合體化與惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤耐藥的關(guān)系，為臨床惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤治療提供新的思路及方法。

1　材料與方法

1.1材料人絨癌細胞株BeWo（北京協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)細胞庫），Ham′s F12培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（四季青生物公司），毛喉素（forskolin）由華誠生物技術(shù)有限公司惠贈，鼠抗人Survivin多克隆抗體（美國Santa Cruze公司），兔抗人PCNA多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司），PCR mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermantas MBI公司），促融素（Syncytin）引物（北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和處理BeWo細胞株用含15%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基在37℃、5% CO2中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，0.125%胰酶和0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。取指數(shù)生長期的BeWo細胞（約占培養(yǎng)皿的70%～80%），分為4組，用終濃度為100 mmol/L forskolin分別作用0，24，48，72 h，其中作用0 h組為空白對照。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Syncytin基因的表達常規(guī)消化并收集細胞，按總RNA提取試劑盒fast200說明提取總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后按PCR mix試劑盒說明進行PCR擴增。以β-actin作為內(nèi)參，引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。各擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用BandScan分析軟件分析電泳結(jié)果。

表1　基因的引物序列

1.2.3蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中Survivin蛋白及PCNA蛋白的表達蛋白質(zhì)提?。撼Ｒ?guī)消化、傳代細胞。當細胞增長至80%時，各培養(yǎng)皿更換含100 mmol/L forskolin的培養(yǎng)基，分別作用0，24，48，72 h。吸凈培養(yǎng)基，4℃磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，將PBS吸凈，加入Triple裂解緩沖液200 μL，將裂解物轉(zhuǎn)移至2.5 mL離心管，充分混勻后離心，將上清液吸出，留待蛋白定量和實驗。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳和免疫印跡：采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，以30 μg/孔上樣，在12%（體積分數(shù)）的SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，電轉(zhuǎn)移法23 V 12 h將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，在含0.5 g/L脫脂奶粉的TBST中37℃封閉1 h，分別加入一抗（鼠抗人Survivin多克隆抗體，稀釋度為1∶200或兔抗人PCNA多克隆抗體，稀釋度為1∶200），4℃孵育過夜，TBST充分漂洗（3 min×6次），加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，稀釋度1∶2 000），37℃作用1 h，TBST充分漂洗（3 min×6次），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，觀察結(jié)果。數(shù)據(jù)分析采用凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.4噻唑藍比色分析實驗（MTT）檢測forskolin作用不同時間的BeWo細胞株的增殖情況常規(guī)消化細胞，吹打均勻，調(diào)整細胞濃度為106個/L～107個/L，取上述細胞懸液200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。該實驗分為實驗組和對照組。當細胞增長至80%時，取出96孔板，更換培養(yǎng)基，實驗組用含100 mmol/L forskolin的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h，對照組用不含forskolim的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h。加入5 mg/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒出培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜振蕩溶解10 min?？瞻讓φ照{(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長為490 nm時各孔的吸光度值（A值）。該實驗過程中每組各設(shè)8個復(fù)孔，重復(fù)6次。

1.3統(tǒng)計學方法每組實驗至少重復(fù)3次以上，電泳圖譜掃描圖像用BandScan軟件進行灰度分析。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用重復(fù)測量方差分析，2組各時間點比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1檢測forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中Syncytin基因的表達forskolin作用后的BeWo細胞株Syncytin基因的表達增強，且隨著forskolin作用時間的延長，Syncytin的表達增強，于48 h達到高峰，見圖1。

圖1　forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中Syncytin基因的表達

2.2forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中Survivin蛋白及PCNA蛋白的表達

2.2.1Survivin蛋白的表達forskolin作用后的BeWo細胞株Survivin蛋白的表達下降，且隨著forskolin作用時間的延長，其表達Survivin蛋白減弱，見圖2。

圖2　forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中Survivin蛋白的表達

2.2.2 PCNA蛋白的表達forskolin作用后的BeWo細胞株P(guān)CNA蛋白的表達下降，且隨著forskolin作用時間的延長，其表達PCNA蛋白降低，見圖3。

圖3　forskolin作用不同時間的BeWo細胞株中PCNA蛋白的表達

2.3MTT檢測forskolin作用不同時間的BeWo細胞株的增殖能力forskolin處理后的BeWo細胞株的增殖能力下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。隨著forskolin作用時間延長，BeWo細胞株增殖能力下降越明顯（F時間=7.642，P=0.001；F組別=5.702，P=0.021；F交互=1.301，P=0.611），見表2。

表2　forskolin作用不同時間的BeWo細胞株的增殖情況

3　討論

GTT是一類來源于胎盤妊娠滋養(yǎng)細胞的常見婦科惡性腫瘤，好發(fā)于生育年齡婦女，其發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異。在北美洲，葡萄胎妊娠的發(fā)生率為0.6‰～1.1‰，而在東南亞國家及猶太人種族葡萄胎妊娠的發(fā)生率比北美及歐洲高7～10倍。由于中國龐大的妊娠婦女基數(shù)，使GTT成為嚴重威脅中國育齡婦女生命健康的惡性疾病之一。GTT亦是人體內(nèi)能用化療藥物完全治愈的實體腫瘤之一。據(jù)報道，無轉(zhuǎn)移和低危轉(zhuǎn)移的滋養(yǎng)細胞腫瘤患者的治愈率幾乎達100%。復(fù)發(fā)、晚期和耐藥病例是GTT治療的難點，也是患者的主要死因，約占死亡原因70%，故解決GTT耐藥、復(fù)發(fā)的問題已經(jīng)成為該腫瘤的研究重點。

3.1細胞融合細胞融合在細胞生物界中是非常少見的現(xiàn)象。在人體組織中存在3種典型的合胞體組織，即合體滋養(yǎng)細胞層、橫紋肌纖維、軟骨或破骨細胞。晶狀體纖維可能也具有融合活性。細胞合體化是一種特殊的分化途徑，在生物體的正常生長、發(fā)育過程中起了非常重要的作用。在正常妊娠過程中，胎盤絨毛組織中細胞滋養(yǎng)細胞通過增殖、分化，最終融合形成合體滋養(yǎng)細胞，在胎盤正常結(jié)構(gòu)的形成和維持胎兒正常生長、發(fā)育等方面起了重要作用。目前關(guān)于滋養(yǎng)細胞合體化的具體機制尚不明了。有研究認為這可能與滋養(yǎng)細胞特異性表達的一種膜糖蛋白Syncytin有關(guān)。

Syncytin是人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因HERVWE1編碼的膜糖蛋白，由538個氨基酸組成的，具有促進細胞融合的作用。Blond等[3]將表達HERV-W Env的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染親代的TE671細胞（人成神經(jīng)管細胞瘤細胞系），使之暫時表達HERV-W Env，1～2 d后發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致大量的多核巨細胞和合胞體形成，表明Syncytin可介導(dǎo)細胞的融合。Syncytin的表達受到多種因素的影響。有資料顯示，低氧、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase-1，SOD-1）可以抑制Syncytin的表達，而粒細胞-巨噬細胞刺激因子、表皮生長因子、forskolin、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、地塞米松、雌激素、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、膠質(zhì)細胞缺失因子1（GCM-1）等可以誘導(dǎo)Syncytin的表達[4]。forskolin是一種常用的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，其可以通透細胞，激活腺苷酸環(huán)化酶，引起細胞內(nèi)cAMP水平的升高，誘導(dǎo)Syncytin的表達。國內(nèi)外許多研究證實forskolin可以通過誘導(dǎo)Syncytin的表達促進細胞的融合。Borges等[5]應(yīng)用細胞質(zhì)熒光標記方法來觀察forskolin誘導(dǎo)絨癌細胞株BeWo融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種不同細胞質(zhì)熒光染料標記的細胞在forskolin作用下共同培養(yǎng)一段時間后同一細胞的細胞質(zhì)中出現(xiàn)了兩種不同的熒光，說明forskolin可以誘導(dǎo)BeWo細胞株融合，且于forskolin作用48 h達到高峰。本研究應(yīng)用RT-PCR檢測了forskolin作用不同時間后BeWo細胞株中Syncytin mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Syncytin在forskolin處理后的細胞中表達增強，且隨著forskolin作用時間的延長，其表達增強，并于48 h達到高峰，證實了forskolin可以誘導(dǎo)Syncytin基因的表達。

3.2細胞融合與細胞增殖妊娠滋養(yǎng)細胞包括細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞兩種。細胞滋養(yǎng)細胞是一種具有增殖能力的細胞，其可以通過增殖、分化，最終融合形成合體滋養(yǎng)細胞。細胞滋養(yǎng)細胞融合形成合體滋養(yǎng)細胞后在形態(tài)和生化等方面發(fā)生了特征性的改變。合體滋養(yǎng)細胞是一種多核細胞，處于細胞分化的終末期，已脫離細胞周期，不具有合成、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的能力，但能分泌多種激素，如hCG、雌激素、孕激素、人胎盤泌乳素等。Martin等[6]通過亞顯微結(jié)構(gòu)和酶組織化學研究，發(fā)現(xiàn)合體滋養(yǎng)細胞中出現(xiàn)許多細胞老化現(xiàn)象，如核糖體的丟失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脫粒、染色質(zhì)的凝集以及與細胞能量代謝有關(guān)的酶的失活。本研究應(yīng)用MTT檢測了forskolin作用不同時間的BeWo細胞株的增殖情況，發(fā)現(xiàn)同對照組比較，forskolin處理后的BeWo細胞株的增殖能力下降，且隨著forskolin作用時間的延長，其增殖能力下降越明顯，說明forskolin誘導(dǎo)融合后的BeWo細胞株增殖能力下降。

PCNA由Miyachi等首次發(fā)現(xiàn)，廣泛表達于各類組織的增殖細胞中，是一種與細胞周期相關(guān)的多肽鏈，在DNA主鏈復(fù)制、修復(fù)，正常細胞周期循環(huán)中必不可少，同時也是一種細胞周期調(diào)控蛋白，存在于細胞核中，作為DNA聚合酶的輔助蛋白，直接參與細胞增殖過程中DNA復(fù)制，其表達水平反映腫瘤細胞增殖情況[7-8]。Survivin由Ambrosini等首次從人類基因組庫中分離出來，是迄今已知最強的凋亡抑制蛋白，具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、參與細胞周期調(diào)控、參與并促進血管形成等功能，其主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織中，在大多數(shù)分化成熟的正常成人組織中沒有表達[9-10]。Survivin、PCNA蛋白都是與細胞增殖相關(guān)的蛋白，其表達下降說明細胞的增殖下降。本研究發(fā)現(xiàn)forskolin處理后的BeWo細胞株中Survivin和PCNA蛋白的表達均下降，且隨著forskolin作用時間的延長，其表達減弱，進一步說明forskolin誘導(dǎo)融合后的BeWo細胞株的增殖能力下降。

合體滋養(yǎng)細胞是處于分化終末期的細胞，已脫離細胞周期，不再具有細胞增殖的能力。腫瘤的發(fā)生是一個多途徑、多步驟的過程。原癌基因、癌基因的激活和抑癌基因的失活，擾亂了細胞正常的增殖、分化調(diào)控，導(dǎo)致細胞增殖失控。而細胞凋亡的抑制，導(dǎo)致細胞存活期延長，死亡率下降。細胞的過度增殖和細胞凋亡的抑制打破了細胞增殖和凋亡的平衡，破壞了機體內(nèi)細胞的平衡，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。腫瘤治療的目的在于殺傷腫瘤細胞。目前臨床上治療腫瘤最常用的方法是放療和化療。雖然其治療腫瘤的機制是多方面的，但近來許多研究發(fā)現(xiàn)放療和化療均可引起腫瘤細胞凋亡，且可能是腫瘤細胞死亡的主要方式。本研究發(fā)現(xiàn)合體化后的BeWo細胞株中參與細胞增殖的PCNA蛋白和抑制細胞凋亡的Survivin蛋白的表達均下降，說明合體化后BeWo細胞株細胞增殖能力降低，細胞凋亡增加，推測細胞合體化可能可以增強滋養(yǎng)細胞腫瘤對化療藥物的敏感性。但關(guān)于滋養(yǎng)細胞合體化是否能夠改善滋養(yǎng)細胞腫瘤的耐藥性及其具體機制有待進一步研究。

參考文獻

[1]王慰敏，安瑞芳.葡萄胎的診治進展[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2009，25（5）：259-261.

[2]安瑞芳，謝麗，王姝，等.妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中各型滋養(yǎng)細胞增殖情況的研究[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2008，24（12）：720-723.

[3]Blond JL，Lavillette D，Cheynet V，et al. An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor[J]. J Virol，2000，74（7）：3321-3329.

[4]王若紅，姚源蓉，謝炳玓，等. Syncytin 1的細胞特異性表達及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2011，21（35）：4363-4366.

[5]Borges M，Bose P，F(xiàn)rank HG，et al. A two -colour fluorescence assay for the measurement of syncytial fusion between trophoblastderived cell lines[J]. Placenta，2003，24（10）：959-964.

[6]Martin BJ，Spicer SS. Ultrastructural features of cellular maturation and aging in human trophoblast[J]. J Ultrastruct Res，1973，43（1）：133-149.

[7]Strzalka W，Ziemienowicz A. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a key factor in DNA replication and cell cycle regulation [J]. Ann Bot，2011，107（7）：1127-1140.

[8]居紅格，沈淑萍，耿紅，等. P16、P53、PCNA在膀胱癌中的表達及意義[J].包頭醫(yī)學院學報，2009，25（6）：12-13.

[9]趙禎，匡安仁.凋亡抑制蛋白Survivin研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（24）：4761-4764.

[10]曲貝貝，左金華.凋亡抑制基因Survivin的研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2014，8（15）：2842-2846.

[本文編輯王昕]

Expressions of PCNA and Survivin Proteins in BeWo Cells during Syncytial Process

YI Li-sha，LIN Yao-

hua，ZHANG Guo-zheng.
Department of Obstetrics and Gynecology，Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Guangzhou 510623，China（YI Li-sha，ZHANG Guo-zheng）；Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan Province，China（LIN Yao-hua）
Corresponding author：ZHANG Guo-zheng，E-mail：zhang710923@163.com

【Abstract】Objective：To observe the expression changes of PCNA and Survivin proteins in the choriocarcinoma cell line（BeWo）during its fusion, so as to explore the proliferation change after the fusion of trophoblast cells. The study could be helpful for developing a new therapy of gestational trophoblastic tumor （GTT）, especially drug-resistant GTT. Methods：The intercellular fusion of the cultured BeWo cells was induced by forskolin. The expression of Syncytin mRNA in the treated BeWo cells was detected by RT-PCR, and the expressions of PCNA and Survivin proteins were detected by Western blotting. The proliferation of BeWo cells was detected by MTT. Results：①The expression of Syncytin gene in the BeWo cell treated with forskolin was increased with a time-dependent manner, which reached its peak in 48 hours.②The expressions of PCNA and Survivin proteins in BeWo cell after treatment were significantly decreased.③The proliferation of the BeWo cell treated with forskolin was significantly decreased with a time -dependent manner. Conclusions：The lowered expressions of PCNA and Survivin proteins in those fusion choriocarcinoma cells means the lowered proliferation, suggesting that the induced intercellular fusion of trophoblast cells may be helpful to treat those malignant GTT.

【Keywords】Proliferating cell nuclear antigen；Microtubule-associated proteins；Forskolin；Cell fusion

作者單位：510623廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產(chǎn)科（易莉莎，張國正）；南華大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（林耀華）

通信作者：張國正，E-mail：zhang710923@163.com

收稿日期：（2015-06-05）