非諾貝特對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變的影響

關(guān)清華，曠勁松，趙玉蓉，程　嵐，張秀彬

(遼寧省沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng)110031)

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非諾貝特對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變的影響

關(guān)清華，曠勁松，趙玉蓉，程嵐，張秀彬

(遼寧省沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng)110031)

[摘要]目的觀察非諾貝特對(duì)早期糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)大鼠視網(wǎng)膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、蛋白激酶C(PKC)表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響,探討非諾貝特防治早期DR的作用機(jī)制。方法將實(shí)驗(yàn)用封閉群4周雄性健康SD大鼠50只隨機(jī)分成正常組(10只)、糖尿病組(20只)和非諾貝特組(20只)。非諾貝特組和糖尿病組均采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射制作糖尿病模型。非諾貝特組每天給予非諾貝特10 mg/kg與飼料混合后喂養(yǎng)，糖尿病組與正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。記錄給藥前及給藥4，8，12，16周時(shí)3組空腹血糖水平。給藥16周后處死大鼠，取眼球，制作視網(wǎng)膜組織切片，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF和PKC蛋白表達(dá)情況，采用原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果給藥4，8，12，16周非諾貝特組和糖尿病組空腹血糖水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，但2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥16周后3組大鼠視網(wǎng)膜VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，其中糖尿病組與非諾貝特組大鼠VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平較正常組明顯上調(diào)(P均<0.05)，但非諾貝特組較糖尿病組明顯降低(P均<0.05)。非諾貝特組及糖尿病組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，但非諾貝特組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于糖尿病組(P<0.05)。結(jié)論非諾貝特可下調(diào)早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和PKC表達(dá)，減少視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡，干預(yù)早期DR的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]糖尿病視網(wǎng)膜病變；非諾貝特；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；蛋白激酶C；細(xì)胞凋亡

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是成人致盲的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其患病率隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而增高。從糖尿病發(fā)病開(kāi)始20年內(nèi)，幾乎所用的1型糖尿病和60%的2型糖尿病都將發(fā)展成不同程度的DR[1]。近年來(lái)，隨著糖尿病發(fā)病率逐漸增高，預(yù)計(jì)DR發(fā)生率將進(jìn)一步升高。故采取有效方式延緩和治療DR具有重要意義。非諾貝特是PPAR-α受體激動(dòng)劑，除可調(diào)節(jié)血脂水平外，有循證醫(yī)學(xué)表明其能延緩DR進(jìn)展，可能起到某種特殊作用[1]。本研究觀察了非諾貝特對(duì)早期DR大鼠視網(wǎng)膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和蛋白激酶C(PKC)蛋白表達(dá)的影響，旨在探討非諾貝特防治早期DR的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模實(shí)驗(yàn)用封閉群雄性健康Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，鼠齡約4周，體質(zhì)量80～100 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2013-0001。隨機(jī)分成正常組(10只)、糖尿病組(20只)和非諾貝特組(20只)。非諾貝特組和糖尿病組均采用STZ (60 mg/kg, 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.0)一次性腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，正常組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。3 d后，正常組大鼠空腹血糖均小于5.6 mmol/L，非諾貝特組和糖尿病組各有18只大鼠成模(空腹血糖大于17 mmol/L)。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由飲水、攝食混合飼料，非諾貝特組每天給予非諾貝特10 mg/kg與飼料混合后喂養(yǎng)，每4周測(cè)1次血糖。其中3只糖尿病模型大鼠于飼養(yǎng)期間死亡，非諾貝特組剩余17只，糖尿病組剩余16只。

1.2眼球標(biāo)本制作飼養(yǎng)3個(gè)月后，過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，立即摘除眼球，于4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液中固定，48 h后流水沖洗,梯度乙醇脫水，在體積分?jǐn)?shù)80%乙醇脫水階段，切除眼前節(jié)；常規(guī)包埋， 4 μm連續(xù)切片，每只眼球取10個(gè)面，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片，行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF和PKC蛋白表達(dá)染色步驟按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用SP法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡下觀察，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用Biosens Digital Imaging System V1.6高清晰度系統(tǒng)病理圖文分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。每個(gè)眼球隨機(jī)選取3張切片，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)選定的圖像所用的陽(yáng)性信號(hào)的光密度值，取平均值。

1.4TUNEL染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況將取出的新鮮視網(wǎng)膜組織用0.9%的NaCl溶液沖洗干凈后浸泡于10%的多聚甲醛中，石蠟包埋后制成石蠟切片，按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。使用Image-Pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，并觀察其表達(dá)部位。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。建模后不同時(shí)期3組大鼠空腹血糖的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，3組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、PKC蛋白表達(dá)水平及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層凋亡細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組大鼠全身情況及血糖水平正常組大鼠毛色白而有光澤，體質(zhì)量逐月增加，活動(dòng)靈敏，生長(zhǎng)迅速。糖尿病組大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體質(zhì)量減輕，毛色變黃，活動(dòng)減少。非諾貝特組大鼠全身癥狀加重程度較糖尿病組輕微。給藥4，8，12，16周時(shí)非諾貝特組和糖尿病組空腹血糖水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，但2組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.23組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果光鏡下正常組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，排列有序；糖尿病組及非諾貝特組各層結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞間距增大，數(shù)目減少，內(nèi)核層萎縮消失，神經(jīng)纖維層變薄，糖尿病組表現(xiàn)更為明顯。見(jiàn)圖1～3。

表1　3組大鼠不同時(shí)期空腹血糖水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.33組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和PKC蛋白表達(dá)及其細(xì)胞凋亡指數(shù)比較糖尿病組與非諾貝特組大鼠VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，但非諾貝特組水平明顯低于糖尿病組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1　正常組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色表現(xiàn)(SP，×400)

圖2　非諾貝特組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色表現(xiàn)(SP，×400)

圖3　DM組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色表現(xiàn)(SP×400)

組別nVEGFPKC細(xì)胞凋亡指數(shù)/%正常組1064.19±7.6540.18±5.670.78±0.14非諾貝特組1779.44±4.61①②90.23±4.80①②3.54±0.43①②糖尿病組16112.36±9.72①123.17±11.09①4.32±0.67①F69.75147.2573.31P<0.05<0.05<0.05

注：①與正常組比較，P<0.05；②與糖尿病組比較，P<0.05。

2.43組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況正常組大鼠視網(wǎng)膜幾乎未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，而非諾貝特組和糖尿病組均可見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，非諾貝特組細(xì)胞凋亡情況較糖尿病組輕微。見(jiàn)圖4～6。

圖4　正常組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況(SP，×400)

3討論

DR作為一種漸進(jìn)性疾病，可導(dǎo)致不可逆性失明，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。近年來(lái)，對(duì)DR發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有了進(jìn)一步理解，一般認(rèn)為VEGF是DR早期病理機(jī)制中最為重要和關(guān)鍵性的一種細(xì)胞因子，其是非增殖性視網(wǎng)膜病變的潛在調(diào)控因子，同時(shí)是增殖性視網(wǎng)膜病變的主要啟動(dòng)因子，視網(wǎng)膜組織中VEGF的表達(dá)受PKC調(diào)控[2-3]。在DR中，VEGF有2個(gè)主要的病理生理功能[4]：①VEGF影響了內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，增加了毛細(xì)血管的滲透性，從而引起了液體外滲和視網(wǎng)膜水腫；②VEGF引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管中白細(xì)胞聚集，導(dǎo)致局部炎癥因子的產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這些都能促進(jìn)血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能失調(diào)，可引起嚴(yán)重的視力損害。DR早期病理改變是基底膜增厚，通透性過(guò)高和微動(dòng)脈瘤形成。這些病理改變隨之而來(lái)的是微血管的閉塞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，誘導(dǎo)VEGF的釋放，VEGF是引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成的有效促有絲分裂劑，然而在糖尿病視網(wǎng)膜中這些新生血管脆性強(qiáng)，很容易破裂，從而進(jìn)一步加重DR。PKC是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，最初發(fā)現(xiàn)用于維持大腦的長(zhǎng)期記憶。高血糖通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)了二乙酰基甘油的產(chǎn)生，二乙酰基甘油是PKC的生理活化劑，在視網(wǎng)膜中PKC的激活似乎主要是PKC-β的激活。經(jīng)典的PKC亞型(PKC-β)在視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)上調(diào)中起到重要作用，參與緊密連接的破壞，增加了白細(xì)胞停滯，與VEGF協(xié)同作用參與了視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病組視網(wǎng)膜組織VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平高于正常組，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道相符。非諾貝特是臨床常用的調(diào)脂藥物之一，可降低血漿中三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平和載脂蛋白B水平，同時(shí)由于其使載脂蛋白AⅠ和Ⅱ過(guò)度表達(dá)，并抑制載脂蛋白CⅢ，故可升高高密度脂蛋白膽固醇水平。FIELD和ACCORD-眼睛研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特對(duì)DR的發(fā)生發(fā)展的保護(hù)效應(yīng)是不依賴血脂水平的，表明在2型糖尿病中非諾貝特對(duì)DR的進(jìn)展可能起到特殊作用[1]。Lingam等[6]研究表明非諾貝特能抑制VEGF通路，改善視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏和白細(xì)胞停滯。NoonanE等[7]提出非諾貝特可改善炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1水平而抑制白細(xì)胞介素-6表達(dá)，還抑制了內(nèi)皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)和C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá),具有明顯抗炎作用。Wong等[8]指出非諾貝特具有抗氧化作用，它可增強(qiáng)超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活性,減少過(guò)氧化物的產(chǎn)生，抑制了PKC信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活，從而減少VEGF的產(chǎn)生。Chen等[9]提出非諾貝特的有益效應(yīng)可被特定PPAR-α拮抗藥阻斷,而且敲除過(guò)氧化物酶體增生物激活受體的DR動(dòng)物模型中觀察不到非諾貝特誘導(dǎo)的VEGF下調(diào)和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏的減輕。可見(jiàn)，非諾貝特對(duì)DR的治療效應(yīng)依賴于眼組織中藥物靶點(diǎn)的存在，同時(shí)證明了這種治療效應(yīng)通過(guò)PPAR-α依賴機(jī)制介導(dǎo)。本研究也觀察到非諾貝特組視網(wǎng)膜組織VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平低于糖尿病組，可以推測(cè)非諾貝特可以降低糖尿病視網(wǎng)膜組織中VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平，從而延緩了DR的發(fā)生發(fā)展。

圖5　非諾貝特組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況(SP，×400)

圖6　糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況(SP，×400)

本研究觀察到正常組大鼠視網(wǎng)膜幾乎未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，而非諾貝特組和糖尿病組均可見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，非諾貝特組細(xì)胞凋亡情況較糖尿病組輕微；同時(shí)半定量分析表明非諾貝特組及糖尿病組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于正常組，但非諾貝特組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于糖尿病組，表明非諾貝特具有減少細(xì)胞凋亡作用。楊宏偉等[10]研究表明糖尿病大鼠細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在內(nèi)層視網(wǎng)膜, 最早于發(fā)病4 周時(shí)出現(xiàn)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,數(shù)量上呈時(shí)間信賴性, 逐漸出現(xiàn)在內(nèi)核層的雙極細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等；且細(xì)胞凋亡的發(fā)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于視網(wǎng)膜血管的變化, 16周前誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變?nèi)蕴幱诒尘捌? 已有凋亡機(jī)制的參與，從而導(dǎo)致視力損傷。非諾貝特具有延長(zhǎng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞存活及減少凋亡效應(yīng)[7-11],本研究結(jié)果與此相符。非諾貝特減少細(xì)胞凋亡的效應(yīng)很可能由于腺苷酸-活化蛋白激酶和內(nèi)皮一氧化氮合酶的激活導(dǎo)致[7]。

此外，非諾貝特組視網(wǎng)膜組織VEGF和PKC蛋白表達(dá)水平仍高于正常組，可見(jiàn)非諾貝特不能完全逆轉(zhuǎn)DR的發(fā)生發(fā)展，還有多種機(jī)制及因素參與DR的進(jìn)展，僅靠降低視網(wǎng)膜組織VEGF和PKC蛋白表達(dá)來(lái)延緩DR的發(fā)展還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要從多方面著手來(lái)延緩其發(fā)生發(fā)展，故應(yīng)該繼續(xù)研究及探討。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)論及既往大規(guī)模臨床觀察研究結(jié)果[12]考慮，糖尿病患者若無(wú)禁忌情況下應(yīng)盡早應(yīng)用非諾貝特，至少在發(fā)生增殖性視網(wǎng)膜病變之前即開(kāi)始應(yīng)用，從而更好地延緩DR的發(fā)生發(fā)展，應(yīng)用非諾貝特與應(yīng)用降糖及降壓藥物同等重要。

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Effects of fenofibrate on early retinopathy in rats with experimental diabetes

GUAN Qinghua, KUANG Jinsong, ZHAO Yurong, CHENG Lan, ZHANG Xiubin

(Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of fenofibrate on vascular endothelial growth factor (VEGF) and protein kinase C (PKC) expression and cell apoptosis in retinal tissue of rats with earlier diabetic retinopathy (DR), and explore the mechanism of fenofibrate for the prevention and treatment of early DR. Methods 50 male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (10 cases), fenofibrate group (20 cases) and diabetes mellitus (DM) group (20 cases). The animals in fenofibrate group and DM group were injected streptozotocin (STZ) intraperitoneally once to set up DM model. Then the animals were fed with fenofibrate (10 mg/kg) and feed mixture in fenofibrate group and normal feed in DM group and normal control group. The blood-fasting glucose at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week were detected. After 16 weeks the rats were sacrificed and retinal tissue was obtained for immunohistochemical staining to detect the expression of VEGF and PKC, the apoptosis in retina was detected by TdT-dUTP terminal nick-end labeling (TUNEL) staining. Results The blood-fasting glucose levels of the fenofibrate group and DM group were significantly higher than that of the normal control group at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week (all P<0.05), but there were no significant difference between the fenofibrate group and DM group (P>0.05). There were significant differences in the expressions of VEGF and PKC at the end of the 16th week among the three groups (all P<0.05), and which were significantly higher in the fenofibrate group and DM group than those in the normal control group (all P<0.05), but that of the fenofibrate group was lower than that of the DM group (P<0.05). The apoptosis index of fenofibrate group and DM group were higher than that of the normal control group (all P<0.05), but which of the fenofibrate group was significantly lower than that of the DM group (P<0.05). Conclusion Fenofibrate can down regulate the expression of VEGF and PKC in retinal tissue of earlier DM rats and reduce the apoptosis of retinal tissue, which may interfere in the development of earlier DR.

Key words:diabetic retinopathy; fenofibrate; vascular endothelial growth factor; protein kinase C; cell apoptosis

[收稿日期]2015-09-05

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)06-0578-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.003

[基金項(xiàng)目]沈陽(yáng)市科技局課題(F11-262-9-25)

[作者簡(jiǎn)介]關(guān)清華，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究。[通信作者]曠勁松， E-mail：kjs_1965@163.com