育腎助孕方對雷公藤多苷致卵巢儲備下降大鼠卵巢形態(tài)和性激素的影響

金毓莉 張婷婷 許華云 袁雪菲 蔡小蓀

摘要：目的 觀察育腎助孕方對雷公藤多苷致卵巢儲備功能下降大鼠卵巢組織形態(tài)和性激素的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用雷公藤多苷藥液灌胃制作卵巢儲備功能下降大鼠模型。48只雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組及育腎助孕方低、中、高劑量組，育腎助孕方各劑組分別給予低、中、高濃度育腎助孕方藥液灌胃，陽性藥組給予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)14 d。觀察大鼠一般情況，取卵巢稱重并計算臟器指數(shù)，HE染色觀察卵巢組織形態(tài)，放射免疫法檢測血清雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）水平，酶聯(lián)免疫吸附法檢測抑制素B（INHB）、抗苗勒管激素（AMH）水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組卵巢組織萎縮，各級卵泡數(shù)目減少，卵巢指數(shù)和E2、INHB、AMH水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高（P<0.01）；與模型組比較，育腎助孕方高劑量組卵巢組織形態(tài)明顯改善，各級卵泡和黃體增加，閉鎖卵泡減少；卵巢指數(shù)和E2、INHB、AMH水平升高，F(xiàn)SH、LH水平降低（P<0.01），且INHB與AMH具有顯著相關(guān)性（P<0.01）。結(jié)論 育腎助孕方可調(diào)節(jié)性激素水平，促進(jìn)卵泡生長和分泌，抑制卵泡閉鎖，從而改善卵巢儲備功能。

關(guān)鍵詞：育腎助孕方；卵巢儲備功能；抑制素B；抗苗勒管激素；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0056-04

Abstract： Objective To observe the effects of Yushen Zhuyun Prescription on ovarian morphology and sex hormone of rats with decreased ovarian reservation （DOR） induced by tripterygium glycosides； To explore its mechanism of action. Methods Tripterygium glycosides solution was used to establish DOR model rats by gastric gavage. 48 female SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive medicine group and Yushen Zhuyun Prescription low-， medium- and high-dose groups. Yushen Zhuyun Prescription groups were given the low， medium， high dosages Yushen Zhuyun Prescription liquid； positive medicine group were given estradiol valerate liquid； model group and blank control group were given normal saline with the same amount， by gavage 2 times per day for 14 consecutive days. The general condition of the rats was observed； ovarian was weighed and the viscera index was calculated； ovarian morphology was observed by HE staining； the levels of serum estradiol （E2）， follicle stimulating hormone （FSH） and testosterone （T） were detected by radioimmunoassay； the levels of inhibin B （INHB） and anti Mullerian hormone （AMH） were detected by ELISA. Results Compared with the blank group， ovarian tissue atrophied； the number of follicles was reduced； ovarian index and the level of E2， INHB and AMH decreased； the levels of FSH and LH increased in the model group （P<0.01）. Compared with the model group， ovarian tissue morphology improved significantly； the number of follicle and corpus luteum increased； follicular atresia was reduced； ovarian index and the levels of E2， INHB， and AMH increased； the levels of FSH and LH decreased in Yushen Zhuyun Prescription high-dose group （P<0.01）. INHB and AMH had significant correlation （P<0.01）. Conclusion Yushen Zhuyun Prescription can regulate hormone levels， promote the growth and secretion of follicle， and inhibit follicular atresia， thereby improve ovarian reserve function.

Key words： Yushen Zhuyun Prescription； ovarian reservation； inhibin B； anti Mullerian hormone； rats

卵巢儲備功能（ovarian reservation，OR）是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育、形成可受精卵泡的能力，反映女性的生育潛能和生殖內(nèi)分泌功能。卵巢儲備功能下降（decreasing ovarian reservation，DOR）是指卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)量減少，卵巢產(chǎn)生卵子能力減弱，卵泡質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力下降[1]，表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕，甚至卵巢早衰等。其臨床發(fā)病率呈上升趨勢，也是目前引起不孕的主要原因之一。中醫(yī)藥在治療不孕不育癥、調(diào)整女性生殖內(nèi)分泌功能失調(diào)性疾病方面有獨(dú)到之處，療效得到肯定。育腎助孕方為蔡氏婦科第7代嫡系傳人蔡小蓀教授的經(jīng)驗方，臨床療效顯著[2]。本實驗觀察該方對DOR大鼠卵巢組織形態(tài)的影響和相關(guān)性激素水平的調(diào)節(jié)作用，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

48只清潔級健康雌性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～280 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于上海市第一人民醫(yī)院清潔級實驗動物中心，自由飲水和攝食。

1.2 藥物

育腎助孕方（熟地黃10 g，山萸肉10 g，醋龜甲10 g，茯苓12 g，鹿角霜10 g，淫羊藿10 g，巴戟天10 g，肉蓯蓉10 g），上述飲片均為中藥免煎顆粒劑，廣州一方中藥廠，用純凈水配制成低、中、高3個濃度混懸藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠坠俣嘬掌?，江蘇美通制藥有限公司，10 mg/片，批號131029；戊酸雌二醇片，Delpharm Lille S.A.S，批號089A2。

1.3 主要試劑與儀器

雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）放射免疫分析藥盒，北京北方生物科技研究所；抑制素（INH）B、抗苗勒氏管激素（AMH）酶聯(lián)免疫試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司）。

1.4 造模、分組及給藥

參照文獻(xiàn)[3]方法，采用雷公藤多苷藥液灌胃制作DOR大鼠模型。配制50 mg/mL雷公藤多苷藥液及0.05 mg/mL濃度戊酸雌二醇藥液。48只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組和育腎助孕低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組8只。給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”[4]計算，中藥低、中、高劑量組分別按臨床等效劑量的0.5倍（0.69 g/kg）、1倍（1.38 g/kg）和2倍（2.76 g/kg）給藥。每日9：00時，造模組灌服雷公藤多苷藥液，15：00時中藥低、中、高劑量組分別予不同濃度育腎助孕方藥液灌胃，陽性藥組予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為12 mL/kg，連續(xù)14 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般狀況觀察 觀測大鼠體質(zhì)量、飲食、活動、動情周期，計算卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)（%）=卵巢質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。

1.5.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 采血后斷頭處死大鼠，立即開腹取出卵巢，稱重，福爾馬林固定，24 h內(nèi)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.5.3 雌二醇、促卵泡刺激素、睪酮檢測 腹腔注射10%水合氯醛（0.6 mL/只）麻醉，腹主動脈取血后迅速置于促凝管中，室溫下靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取血清待用。放射免疫法檢測E2、FSH、T，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5.4 抑制素B、抗苗勒管激素檢測 取上述血清，ELISA檢測INHB、AMH，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，方差齊性數(shù)據(jù)再用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況結(jié)果

空白組大鼠飲食與活動基本無變化，給藥結(jié)束時體質(zhì)量正常增加，動情周期平均每次4～5 d；模型組大鼠飲食量減少，喜蜷縮，對刺激反應(yīng)淡漠，給藥結(jié)束時體質(zhì)量增加相對減少，毛色黯淡、光澤減少，大多數(shù)無動情周期。陽性藥組及中藥高劑量組體質(zhì)量基本正常，飲食、活動無明顯變化，動情周期為5～6 d；中藥低、中劑量組飲食略有減少，自發(fā)性活動略有減少，給藥結(jié)束時體質(zhì)量增加略有減少，動情周期分別為7～9 d、6～7 d。與空白組比較，模型組卵巢指數(shù)下降（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組卵巢指數(shù)均升高，除中藥低劑量組外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01））。結(jié)果見表1。

2.2 卵巢組織病理觀察結(jié)果

空白組卵巢皮質(zhì)與髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，可見各級卵泡（原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡），卵泡形態(tài)、數(shù)量正常，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液含量多，黃體數(shù)目正常，有的可見多個黃體，發(fā)育好、體積大、色澤鮮艷，間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤和纖維化，血管豐富；模型組部分卵巢見萎縮，各期卵泡數(shù)均減少，閉鎖卵泡明顯增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少、排列紊亂，部分黃體數(shù)目減少，且黃體周邊和間質(zhì)區(qū)見有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，未見明顯纖維化；陽性藥組組織形態(tài)學(xué)接近空白組，但閉鎖卵泡明顯增多；中藥低劑量組見各級卵泡，但數(shù)目比空白組少，黃體數(shù)目也減少，間質(zhì)見少量炎細(xì)胞；中藥中劑量組組織形態(tài)接近空白組，有少量閉鎖卵泡；中藥高劑量組組織形態(tài)接近空白組，各級卵泡數(shù)目類似，顆粒細(xì)胞層次豐富，黃體數(shù)目較多，間質(zhì)未見炎細(xì)胞。結(jié)果見圖1。

2.3 育腎助孕方對模型大鼠血清雌二醇、促卵泡刺激素和睪酮水平的影響