路易斯安那鳶尾LiNramp2基因克隆與定量表達(dá)分析

田松青　朱旭東　趙沿海　顧春筍　黃蘇珍

摘 要 利用RACE技術(shù)克隆了路易斯安那鳶尾LiNramp2基因全長(zhǎng)cDNA序列，其大小為1 786 bp，預(yù)測(cè)編碼519個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)具有11次跨膜結(jié)構(gòu)域，與其他Nramp蛋白同源性達(dá)80%以上，說(shuō)明LiNramp2同其他同源基因保守性很高。定量表達(dá)結(jié)果顯示，LiNramp2在路易斯安那鳶尾葉片和雄蕊中表達(dá)量較高，在雌蕊中表達(dá)量最低，根和莖表達(dá)量差別不大。隨著鉛處理時(shí)間增加，LiNramp2基因在根系表現(xiàn)緩慢下降，在葉片中表現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，但差異不顯著。

關(guān)鍵詞 路易斯安那鳶尾；Pb脅迫；LiNramp2；生物信息學(xué)分析；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Louisiana iris is a kind of high ornamental value of perennial plants， found to be tolerance and accumulation of heavy metal Pb. However， research on the molecular tolerance mechanism of Pb was limited. Nramp membrane proteins transport many kinds of metal ions. The intermediate fragment of LiNramp2 was obtained by analyzing the Louisiana iris transcriptome. The LiNramp2 gene was cloned by using RACE technology and its length was 1 786 bp， encoding 519 aa. The protein LiNramp2 was with 11 transmembrane domains， and the conservative analysis found that there were more than 80% similar sites with others of the same source Nramps， showing LiNramp2 was highly conservative with other homologous genes. LiNramp2 expressed more in leaf and rhizome and the lowest in pistil， and the expressions in root and rhizome were not significantly different. The gene expression of LiNramp2 in the root decreased slowly as Pb treatment time increased， in the leaf， increased first and then decreased without significance. This study will be beneficial to further studies of the relationship between LiNramp2 and Pb tolerance of Louisiana iris.

Key words Louisiana iris； Pb stress； LiNramp2； Bioinformatics analysis； RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.024

Nramp蛋白家族（Natural resistance associated macrophage proteins）是廣泛存在細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物中的一個(gè)高度保守的膜蛋白家族，參與如Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+和Co2+等多種金屬離子運(yùn)輸[1]。Nramp蛋白最初在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，造成巨噬細(xì)胞的特異蛋白變異，增加了對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原菌的敏感性，而命名為天然抵抗力相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白[2-3]。在酵母中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)Nramp蛋白SMF1～3，具有調(diào)節(jié)Mn、Cu、Co、Cd、Fe吸收的功能[4-6]。植物中首先發(fā)現(xiàn)水稻（Oryza sativa）的3個(gè)OsNramps1～3蛋白[3，7]，在擬南芥中純化得到了6種Nramp1～6蛋白[8-9]。植物Nramp蛋白可分成2個(gè)亞族：AtNramp1和AtNramp6為一個(gè)亞族，AtNramp2～5為另一個(gè)亞族[10-11]，水稻的OsNramp1和OsNramp3為第一亞族，OsNramp2為第二亞族。植物Nramp蛋白推測(cè)有11或12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMs），并在TM-8和TM-9之間存在一個(gè)特有的“共有運(yùn)輸基序”，也是高度進(jìn)化保守的[9，12]，在根和地上部分都表達(dá)，在質(zhì)膜或液泡膜上轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子[13]。大多數(shù)Nramp 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有運(yùn)輸必需元素的能力，如鐵（Fe）、錳（Mn），也能運(yùn)輸如鎘（Cd）的有毒重金屬。在植物中，這個(gè)特性最初報(bào)道的是AtNrampP3/4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]。AtNramp3/4具有從液泡存儲(chǔ)中再利用Fe和Mn的生理作用，AtNramp3在擬南芥維管束中表達(dá)，可能與金屬長(zhǎng)距離運(yùn)輸有關(guān)，其功能的缺失也導(dǎo)致Cd超敏反應(yīng)[15-18]。AtNramp1是一種高親和性錳的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。AtNramp6基因存在于一個(gè)不同于液泡和線粒體的泡狀內(nèi)膜而對(duì)鎘敏感，AtNramp6的無(wú)效等位基因更耐鎘[19]。Wei等[20]的試驗(yàn)結(jié)果表明，超富集植物遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）同類(lèi)基因TcNramp3/4 可將Cd轉(zhuǎn)運(yùn)至酵母細(xì)胞內(nèi)，對(duì)Ni則相反，TcNrmap3能將Ni外排至酵母細(xì)胞外而提高轉(zhuǎn)化子耐性；轉(zhuǎn)基因煙草亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)TcNRrmap3/4基因均定位在質(zhì)膜上。TcNrmap3能轉(zhuǎn)運(yùn)Fe、Mn、Cd，不能轉(zhuǎn)運(yùn)Zn，TcNrmap4則能運(yùn)輸4種金屬，2個(gè)基因均定位在液泡膜上，而蛋白功能上與AtNrmap3/4沒(méi)有區(qū)別[21]。大麥（Hordeum vulgare）在充足氮供應(yīng)且Cd存在時(shí)Nramp轉(zhuǎn)錄下調(diào)，但當(dāng)缺少氮時(shí)強(qiáng)烈上調(diào)[22]。Ni超富集植物Thlaspi japonicum的TjNramp3基因?qū)Ｒ晦D(zhuǎn)運(yùn)Ni，但是不轉(zhuǎn)運(yùn)Zn、Cd和Mn[23]。最近，有研究結(jié)果表明，OsNamp1參與對(duì)Cd的吸收和在葉中的積累[24-25]，OsNamp5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是水稻吸收Mn的基礎(chǔ)，也是Cd吸收的主要途徑[26-28]?？傊?，不同的Nramp家族起的作用不同，目前關(guān)于Nramp基因家族在高等植物中的功能和其與金屬離子吸收的關(guān)系尚不明確，還有待于進(jìn)一步的研究。

路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）為鳶尾科鳶尾屬（Iris L.）路易斯安那鳶尾系（Iris ser. Hexagonae）的一類(lèi)觀賞濕生植物，原產(chǎn)于美國(guó)墨西哥灣沿岸沼澤。朱旭東等[29]研究結(jié)果表明，低濃度Pb脅迫下路易斯安那鳶尾可通過(guò)自身的抗氧化系統(tǒng)緩解Pb脅迫對(duì)機(jī)體的毒害作用，從而保證植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，具有一定的吸收和忍耐重金屬Pb的能力。該基因在重金屬鉛毒性等中的研究較少，路易斯安那鳶尾Nramp基因目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組序列分析與RACE克隆基因的方法，以路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil的cDNA為模板，克隆Nramp基因家族中的1個(gè)同源基因，命名為L(zhǎng)iNramp2。同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定和分析路易斯安那鳶尾不同組織和不同時(shí)間鉛處理時(shí)的LiNramp2基因表達(dá)量，從而對(duì)路易斯安那鳶尾富集鉛的生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)[29]和生理生化[30]特性進(jìn)一步驗(yàn)證，為進(jìn)一步分析LiNramp2基因的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆、組織器官特異性和響應(yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性定量分析所用試驗(yàn)材料均為路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）主栽品種‘Professor Neil?；蚩寺『晚憫?yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性定量分析試驗(yàn)選取在秋季分蘗旺盛時(shí)期生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好的分株苗。組織特異性定量分析試驗(yàn)選用春季盛花期花朵正開(kāi)的包括花、葉、根狀莖和根的完整植株。

1.2 方法

1.2.1 路易斯安那鳶尾LiNramp2基因克隆 （1）提取總 RNA 和合成cDNA。試驗(yàn)于2013年9月在南京中山植物園溫室進(jìn)行。將路易斯安那鳶尾分株苗用1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液水培預(yù)培養(yǎng)30 d后，采集新鮮葉片和根系。利用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑提取新鮮葉片和根系總RNA。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280，鑒定總RNA質(zhì)量?？俁NA的第一鏈cDNA采用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒（TaKaRa，日本，具體見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）合成。

（2）LiNramp2基因中間片段克隆。從路易斯安那鳶尾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出LiNramp2基因相關(guān)序列片段信息（comp160718_c0_seq1）。利用Primer 5和Oligo 7軟件根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的信息設(shè)計(jì)中間片段引物（表1），利用已合成的cDNA經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增LiNramp2基因中間片段，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增得到LiNramp2基因的中間片段進(jìn)行電泳切膠回收，然后連接到T載體上，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

（3）LiNramp2基因3′端序列克隆。利用 Primer 5和Oligo 7軟件，根據(jù)測(cè)序獲得的LiNramp2基因中間片段設(shè)計(jì)3′端特異PCR引物（表1）。采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得LiNramp2基因的3′端序列。

（4）LiNramp2基因5′端序列克隆。利用 Primer 5和Oligo 7軟件，根據(jù)測(cè)序獲得的中間序列設(shè)計(jì) 5′端正向PCR引物和反向特異PCR引物（表1）。采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends， Version 2.0試劑盒獲得LiNramp2基因的5′端序列。

（5）序列拼接。采用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的5′端序列、3′端序列和中間序列進(jìn)行首尾拼接，得到LiNramp2基因的全序列。

1.2.2 路易斯安那鳶尾LiNramp家族基因編碼蛋白和生物信息學(xué)分析 使用Oligo 7軟件分析LiNramp2基因編碼的氨基酸序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選LiNramp2的同源氨基酸序列，通過(guò) AlignX軟件分析LiNramp2基因編碼的氨基酸序列的保守性，并基于此基因編碼的氨基酸序列，利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構(gòu)建同源氨基酸序列的系統(tǒng)樹(shù)，分析同源氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系。采用SOPMA軟件在線分析LiNramp2基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。LiNramp2蛋白保守結(jié)構(gòu)域的查找通過(guò)http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast完成。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在http：//swissmodel.expasy.org上進(jìn)行，并通過(guò)http：//www.ebi.ac.uk/InterProScan尋找該類(lèi)蛋白在不同物種中的分布。

1.2.3 路易斯安那鳶尾LiNramp2基因在不同組織以及響應(yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性分析 （1）樣品制備。開(kāi)花季節(jié)對(duì)路易斯安那鳶尾成年植株的根、莖、葉和花等組織各取樣3份，用于LiNramp2基因組織特異性表達(dá)分析試驗(yàn)。對(duì)分株苗進(jìn)行0、1、3、6、12、24 h不同時(shí)間長(zhǎng)度的鉛（200 mg/L）脅迫，采集脅迫的根和葉組織各3份，用于LiNramp2基因響應(yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性分析試驗(yàn)。采集的樣品用無(wú)菌水清洗后用錫箔紙包好，立即放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨aKaRa試劑盒提取樣品總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)已克隆的基因序列用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物（表2）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR GREEN染料法，以UBC為內(nèi)參基因，做相對(duì)定量檢測(cè)。將上述提取備用樣品的cDNA置于定量PCR儀LightCycler3（Roche 公司）中，設(shè)定熒光采集通道以及讀取熒光步驟。其PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。結(jié)束后最后加入溶解曲線程序：95 ℃ 0 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的CT值，假定擴(kuò)增效率為100%，并假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之間的效率保持一致，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平采用2-△△CT的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。數(shù)據(jù)用鄧肯多重比較進(jìn)行顯著差異性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LiNramp2基因全長(zhǎng)及生物學(xué)信息分析

2.1.1 基因全長(zhǎng)及編碼蛋白質(zhì) 由設(shè)計(jì)的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增到LiNramp2基因的中間片段，長(zhǎng)度為1 064 bp（圖1-A）。根據(jù)獲得的中間片段序列，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為352 bp的序列（圖1-B）；5′RACE擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為676 bp的序列（圖1-C）。將擴(kuò)增到的LiNramp2中間片段、3′端序列和5′端序列用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到LiNramp2基因的完整序列（圖2），總長(zhǎng)度為1 786 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 557 bp，5′非編碼區(qū)30 bp，3′非編碼區(qū)199 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)含519個(gè)氨基酸。

2.1.2 LiNramp2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu) 通過(guò)SOPMA軟件在線分析，LiNramp2基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)LiNramp2中α螺旋（α-Helix）占46.63%，延伸鏈（Extend strand）占23.51%，不規(guī)則螺旋（Random coil）占21.39%（圖3），α-螺旋是LiNramp2最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。TMHMM軟件在線分析LiNramp2蛋白質(zhì)具有11次跨膜結(jié)構(gòu)，這與跨膜蛋白特征相符合（圖4）。

2.1.3 LiNramp2蛋白質(zhì)保守性及進(jìn)化樹(shù)分析 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中直接搜索LiNramp2氨基酸序列與利用LiNramp2氨基酸序列blastp的方法，從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出10種同源氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）、Solanum lycopersicum、蕓苔（Brassica rapa）、桑樹(shù)（Morus notabilis）、海棗（Phoenix dactylifera）、狗尾草（Setaria italica）、短柄草（Brachypodium distachyon）、短藥野生稻（Oryza brachyantha）和梅（Prunus mume）。利用Clustalw軟件分析LiNramp2和這10種同源氨基酸序列，其相似位點(diǎn)占85.8%（圖5中彩色部分），相同位點(diǎn)占48.0%（圖5中黃色部分），說(shuō)明LiNramp2同源氨基酸間有較高的保守性。

利用MEGA6分析這11種同源氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系（圖6），反應(yīng)了同科間的LiNramp2關(guān)系較近，如禾本科（水稻、狗尾草、短柄草、短藥野生稻）與十字花科（擬南芥和蕓苔）植物。路易斯安那鳶尾LiNramp2與海棗關(guān)系最近，再與單子葉植物綱禾本科關(guān)系較近，與其他植物關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 路易斯安那鳶尾LiNramp2在不同組織的表達(dá)特性分析

如圖7所示，路易斯安那鳶尾基因LiNramp2在不同組織表達(dá)量大小順序?yàn)椋盒廴?葉>外花瓣>內(nèi)花瓣>根>根狀莖>雌蕊，其中雄蕊最高，雌蕊最低。總體上LiNramp2在路易斯安那葉片和雄蕊中表達(dá)較高，一直在雌蕊中表達(dá)最低，根和根狀莖中表達(dá)量差別不大，根中稍高于根狀莖中。

2.3 路易斯安那鳶尾LiNramp2響應(yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性分析

不同LiNramp2基因在路易斯安那鳶尾根系和葉片兩組織中的轉(zhuǎn)錄水平不一樣，在根系中表達(dá)普遍比在葉片中表達(dá)高（圖8）。隨著鉛處理時(shí)間增加，LiNramp2基因在根系表現(xiàn)緩慢下降，在葉片中表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，總體上沒(méi)有顯著差異（p>0.5）。

3 討論與結(jié)論

植物基本礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收與有毒重金屬的積累密切相關(guān)。通常，有毒重金屬進(jìn)入并分布到植物體內(nèi)，是通過(guò)從環(huán)境吸收礦質(zhì)必需元素的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[28]。重金屬的毒性原因往往也是礦質(zhì)必需元素和有毒金屬之間競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生的。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在植物體內(nèi)礦質(zhì)必需元素運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且可轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬，同時(shí)也參與金屬穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。雖然最近已鑒定出很多重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，但只是集中在少數(shù)的植物和幾種重金屬中，且不同蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的類(lèi)型以及在細(xì)胞、組織中的定位都不是很清楚。為了進(jìn)一步解讀植物重金屬積累能力和對(duì)有毒重金屬抗性發(fā)生機(jī)理及機(jī)制，本文成功克隆了重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族LiNramp2基因，并對(duì)其表達(dá)部位和對(duì)鉛脅迫所表達(dá)特性進(jìn)行了探討。

對(duì)于水稻和擬南芥等已完成DNA基因組測(cè)序的模式植物或重要作物等來(lái)說(shuō)，可以直接設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)克隆所需要的基因。而對(duì)于缺乏DNA基因組測(cè)序的路易斯安那鳶尾來(lái)說(shuō)，對(duì)照轉(zhuǎn)錄組所得到的序列，采用RACE方法可以對(duì)所需要的基因進(jìn)行同源克隆。根據(jù)這一方法本文從路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil中克隆了LiNrmap基因家族中的這一同源基因?？寺〉腖iNramp2基因全長(zhǎng)為1 786 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)含519個(gè)氨基酸。質(zhì)膜或液泡膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nramp參與重金屬脅迫的防御機(jī)制[28]，這些蛋白的N端通常包含多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本研究采用TMHMM軟件工具對(duì)克隆的基因進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示，LiNramp2蛋白的N-末端具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與其他物種Nramp蛋白相一致[9，12]。

路易斯安那鳶尾響應(yīng)鉛脅迫的表達(dá)特性分析表明，LiNramp2對(duì)鉛脅迫不敏感，在鉛處理后的24 h時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平有較少提高，而且在葉中表達(dá)比根中高。這與OsNamp1參與對(duì)Cd的吸收和在葉中的積累相一致[24-25]，可能與葉中積累鉛有關(guān)。對(duì)比兩者試驗(yàn)結(jié)果，初步預(yù)測(cè)該基因確實(shí)編碼跨膜運(yùn)輸?shù)鞍祝赡茉诟蚯o運(yùn)輸重金屬鉛中發(fā)揮著重要的作用。

當(dāng)然植物如何適應(yīng)重金屬的脅迫是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，Nramp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在鉛吸收、去毒化和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面研究幾乎是空白，本次研究只能初步探討，下一步將進(jìn)一步研究在更長(zhǎng)的脅迫時(shí)間、野外條件、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等方面，同時(shí)也可根據(jù)本次試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)克隆同家族基因，為進(jìn)一步研究本家族基因與植物鉛吸收、去毒化和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系提供參考。

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責(zé)任編輯：趙軍明