環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中的應(yīng)用

易小平　夏啟玉　郭安平

摘 要 轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性一直存在著較大的爭(zhēng)議，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品仍持謹(jǐn)慎態(tài)度。因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的安全監(jiān)管至關(guān)重要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種恒溫核酸擴(kuò)增的技術(shù)，其設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、結(jié)果可視化，且靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因等檢測(cè)行業(yè)。介紹了LAMP技術(shù)的原理、特點(diǎn)和聯(lián)合應(yīng)用其他技術(shù)，及其在轉(zhuǎn)基因作物與產(chǎn)品檢測(cè)方面的應(yīng)用情況。

關(guān)鍵詞 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；轉(zhuǎn)基因作物；成分檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The safety of genetically modified crops and their products has always been under controversy； People remain cautious about transgenic products. Therefore， fast， accurate and sensitive detection methods for transgenic ingredients are very important to the safety supervision of genetically modified organisms. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a kind of isothermal nucleic acids amplification technology. Due to its simple equipment， low cost， result visualization and high sensitivity， LAMP has been widely used in detections of bacteria， viruses， parasites， transgenic ingredients， etc. In this paper， we reviewed the principle， characteristics， and combined application with other technology of LAMP and its applications in detection of genetically modified crops and their products.

Key words Loop-mediated isothermal amplification； Genetically modified crops； Ingredient detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.030

轉(zhuǎn)基因是一項(xiàng)新技術(shù)，是一個(gè)新產(chǎn)業(yè)，具有廣闊的發(fā)展前景。自1996年轉(zhuǎn)基因番茄商業(yè)化種植以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積越來(lái)越大。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織發(fā)布的報(bào)告稱(chēng)，2014年全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積達(dá)1.815億hm2，比2013年增加了630萬(wàn)hm2[1]。但是，長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的食用安全和環(huán)境安全一直存在爭(zhēng)議。我國(guó)于2001年頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，旨在加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理。目前我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因問(wèn)題的態(tài)度，一是確保安全，二是要自主創(chuàng)新。也就是說(shuō)，在研究上要大膽，在推廣上要慎重。迄今為止，我國(guó)只批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因棉花和木瓜的商業(yè)化種植，還未批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因主糧的商品化生產(chǎn)。2009年，我國(guó)發(fā)放了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻華恢1號(hào)和Bt汕優(yōu)63在湖北省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書(shū)，并于2014年12月11日續(xù)簽5年，但仍未批準(zhǔn)商業(yè)種植。但是，我國(guó)出口的米制品中屢次檢出轉(zhuǎn)基因成分，非法種植銷(xiāo)售轉(zhuǎn)基因作物的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生，因此，我國(guó)還需要進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因生物安全的監(jiān)管工作。

快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管的重要工具。目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中使用最多的是基于核酸序列的PCR方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，與常規(guī)PCR相比，其設(shè)備簡(jiǎn)單，特異性好，靈敏度高，結(jié)果肉眼可視，因此，很適合于基層或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。該方法已廣泛應(yīng)用于微生物病原、寄生蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因成分等領(lǐng)域的快速檢測(cè)[2-3]。本研究介紹了LAMP的原理、特點(diǎn)、聯(lián)合應(yīng)用其他技術(shù)及其在轉(zhuǎn)基因作物與產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

LAMP是日本榮研株式會(huì)社的Notomi等[4]開(kāi)發(fā)的一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，30～60 min左右即可完成核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生大量白色沉淀，用肉眼觀察就能鑒定擴(kuò)增與否。

LAMP技術(shù)需要一對(duì)外引物F3與B3和一對(duì)內(nèi)引物FIP與BIP特異性的識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，其中FIP由F1c和F2組成，BIP由B1c和B2組成（圖1）。

LAMP反應(yīng)在Bst DNA聚合酶的作用下，在60～65 ℃下不停的進(jìn)行鏈置換DNA合成，達(dá)到核酸擴(kuò)增的目的。LAMP的擴(kuò)增原理[5]見(jiàn)圖2和圖3，擴(kuò)增分兩個(gè)階段：起始階段和擴(kuò)增循環(huán)與延伸階段，最終形成的擴(kuò)增產(chǎn)物是有許多環(huán)的花椰菜形狀的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA。

1.1 特點(diǎn)

LAMP與最常用的PCR技術(shù)相比，具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）設(shè)備簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速。只需要一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱即可；30～60 min就可完成擴(kuò)增反應(yīng)。（2）擴(kuò)增效率高。可在30～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增[6]，靈敏度比普通PCR技術(shù)要高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[7-8]。（3）特異性高。LAMP的4條引物特異性的匹配模板上的6個(gè)區(qū)域，任何一個(gè)區(qū)域不匹配就無(wú)法完成擴(kuò)增。（4）結(jié)果可肉眼觀察。

LAMP也存在一些缺點(diǎn)，如產(chǎn)物檢測(cè)是終點(diǎn)檢測(cè)，無(wú)法區(qū)分非特異性擴(kuò)增和引物二聚體引起的假陽(yáng)性；LAMP反應(yīng)開(kāi)蓋易造成氣溶膠污染。此外，LAMP反應(yīng)的靶序列最好控制在300 bp以下，大的片段較難擴(kuò)增。

1.2 產(chǎn)物檢測(cè)

1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳 電泳檢測(cè)可見(jiàn)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是大小不等的DNA片段組成，呈現(xiàn)出特異的梯狀條帶。電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物需要特定的儀器設(shè)備，耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要。

1.2.2 濁度觀察法 LAMP擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+反應(yīng)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，因此肉眼觀察即可判斷擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生與否：若反應(yīng)管內(nèi)液體渾濁，離心或靜置后有白色沉淀則為陽(yáng)性，否則為陰性。LAMP反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀的生成量與DNA生成量之間呈線(xiàn)性關(guān)系，因此可對(duì)起始模板定量，并且焦磷酸鎂沉淀在400 nm處有吸收峰，使得LAMP反應(yīng)可通過(guò)濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量和定性分析[9-10]。濁度法可避免開(kāi)蓋污染。目前已有商品化恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度儀出售。

1.2.3 顏色觀察法 LAMP反應(yīng)可通過(guò)添加熒光染料后的顏色變化來(lái)鑒定擴(kuò)增與否。常用的有SYBR Green I、鈣黃綠素[11]、羥基萘酚藍(lán)（HNB）[12]等。添加SYBR Green I時(shí)，若發(fā)生了擴(kuò)增，LAMP反應(yīng)液由橙色變?yōu)榫G色。添加鈣黃綠素檢測(cè)時(shí)，若發(fā)生了擴(kuò)增，反應(yīng)液由橙色變?yōu)榫G色，但是加入了Mn2+導(dǎo)致反應(yīng)靈敏度降低。HNB不需額外添加成分，靈敏度與SYBR Green I相當(dāng)，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。鈣黃綠素和HNB均可在反應(yīng)前加入，可避免開(kāi)蓋污染；但SYBR Green I要在反應(yīng)結(jié)束后才加入，因?yàn)轱@色需要的SYBR Green I的濃度會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。有研究者在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，再將SYBR Green I點(diǎn)加在管壁或管蓋里，待反應(yīng)完成后顛倒反應(yīng)管混勻來(lái)觀察顏色變化，也無(wú)需開(kāi)蓋；此外，還有商業(yè)化的特制的LAMP反應(yīng)管。

除了以上終點(diǎn)檢測(cè)法外，LAMP還可以利用熒光染料[13-14]、熒光素酶[15]等進(jìn)行實(shí)時(shí)定性或定量檢測(cè)，目前已有多家公司出售恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增檢測(cè)儀。

1.3 技術(shù)改進(jìn)

Nagamine等[16]通過(guò)在F2、F1 之間和B2、B1之間增加上游環(huán)狀引物（LF）和下游環(huán)狀引物（LB），可使反應(yīng)時(shí)間縮短至30 min，提高了檢測(cè)效率。Yano等[17]通過(guò)加入環(huán)引物的LAMP方法對(duì)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的熱敏腸毒素LT1及耐熱腸毒素ST1基因進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間僅需35 min。由于LAMP的引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，為方便LAMP引物的設(shè)計(jì)，LAMP 引物設(shè)計(jì)可由專(zhuān)門(mén)的在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站完成（http：//primerexplorer.jp/e/）。

LAMP技術(shù)是針對(duì)DNA進(jìn)行的檢測(cè)，但在反應(yīng)體系中直接加入反轉(zhuǎn)錄酶可進(jìn)行RT-LAMP，用來(lái)對(duì)RNA病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，省去了反轉(zhuǎn)錄步驟，極大縮短了RNA病毒檢測(cè)的時(shí)間；RT-LAMP方法中也可以通過(guò)加入環(huán)引物的方式進(jìn)一步縮短擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間，提高檢測(cè)效率[18]。

此外，NEB公司開(kāi)發(fā)的新型Bst鏈置換聚合酶（Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase），具有熱啟動(dòng)活性，而且比普通的Bst酶具有更快的延伸活性，有效的提高了LAMP的擴(kuò)增效率。

2 LAMP與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

2.1 結(jié)合DNA探針技術(shù)

LAMP雖然特異性較高，但是其結(jié)果觀察還是不能避免非特異性產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性。利用探針標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行LAMP，可以有效避免非特異性擴(kuò)增引起的假陽(yáng)性問(wèn)題。Mori等[19]在LAMP反應(yīng)體系中加入與模板片段互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的探針，反應(yīng)完后，再加入陽(yáng)離子多聚物聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI），PEI與LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生PEI-DNA復(fù)合物沉淀，在紫外燈下觀察沉淀中擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段上結(jié)合的探針的熒光，可以特異性檢測(cè)目的片段。申建維等[20]用多重LAMP同時(shí)擴(kuò)增耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）耐藥基因mecA和fem A，在反應(yīng)過(guò)程中，兩種分子信標(biāo)熒光探針（FAM和TET）分別與mecA和femA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)管中的兩種熒光值來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，檢測(cè)限為10 CFU/mL。Tani等[21]利用alternately binding quenching（AB-Q）探針建立了一種ABC-LAMP技術(shù)，快速成功的對(duì)氨氧化酶基因amoA基因進(jìn)行定量分析。除了熒光標(biāo)記的探針外，納米金標(biāo)記的探針也很好地應(yīng)用于LAMP中。Jaroenram等[22]首次將納米金顆粒標(biāo)記的DNA探針應(yīng)用于LAMP，用于蝦黃頭癥病毒（yellow head virus，YHV）的鑒定。LAMP產(chǎn)物與納米金標(biāo)記的探針雜交5 min后，混合物中加入一定濃度的氯化鎂溶液，若無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，由于鹽的屏蔽效應(yīng)，納米金顆粒會(huì)聚合到一起，使原本紅色的溶液變?yōu)樗{(lán)紫色。此方法還可以用紫外可見(jiàn)光光譜法進(jìn)行定量分析。該方法還成功應(yīng)用于對(duì)蝦野田村病毒（Penaeus vannamei nodavirus，PvNV）[23]、蝦傳染性肌肉溶解病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）[24]、白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）[25]和對(duì)蝦腸孢子蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei）[26]的檢測(cè)。

2.2 結(jié)合橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)

Kiatpathomchai等[27]首次將橫向流動(dòng)試紙條（Lateral flow dipstick，LFD）與LAMP結(jié)合，成功建立了對(duì)蝦桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）的LAMP-LFD檢測(cè)技術(shù)。在LFD檢測(cè)反應(yīng)中，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，結(jié)合在LFD上具有生物素抗體的檢測(cè)線(xiàn)上；未雜交的FITC標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)而結(jié)合在控制線(xiàn)上，完成顯色和結(jié)果判斷。該方法的顯色依賴(lài)于探針與目的核酸序列之間的特異性雜交，非特異性擴(kuò)增無(wú)法顯色，解決了終點(diǎn)檢測(cè)時(shí)無(wú)法區(qū)分非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。Jaroenram等[28]建立了對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的LAMP-LFD檢測(cè)方法，50 min內(nèi)完成從DNA提取到LFD顯色，靈敏度與巢式PCR相當(dāng)。Njiru[29]建立了快速靈敏的檢測(cè)非洲人類(lèi)錐蟲(chóng)病（human African trypanosomiasis，HAT）病原的LAMP-LFD方法。國(guó)內(nèi)也有一些LAMP-LFD的報(bào)道，如Wang[30]建立了轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready soybean（RRS）的LAMP-LFD檢測(cè)方法，檢測(cè)限為20拷貝質(zhì)粒模板，是普通PCR的20倍。董培培等[31]利用LAMP-LFD技術(shù)實(shí)現(xiàn)了鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）的快速檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程可在30 min內(nèi)完成，檢測(cè)限為7.7 CFU/mL。其他研究者也相繼建立了創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）[32]、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）[33]和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）[34]的LAMP-LFD檢測(cè)方法。LAMP-LFD法檢測(cè)條件簡(jiǎn)單，特異性顯色目的核酸片段，適用于基層實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)使用，目前已有商品化的核酸試紙條出售。

2.3 結(jié)合生物芯片技術(shù)

生物芯片是通過(guò)縮微技術(shù)，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)從生物化學(xué)反應(yīng)到結(jié)果檢測(cè)分析的所有功能，具有集成化、自動(dòng)化、快速高效、高通量等特點(diǎn)。聯(lián)合應(yīng)用芯片技術(shù)和LAMP是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究者將LAMP與芯片聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道很多。羅磊等[35]研制了一款基于芯片技術(shù)的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)平臺(tái)及相應(yīng)的檢測(cè)控制系統(tǒng)，在此LAMP芯片上進(jìn)行了金葡菌（Staphylococcus aureus）LAMP反應(yīng)最佳擴(kuò)增條件的研究。Fang等[36]將LAMP整合于8通道的微流體芯片上，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的白色沉淀肉眼即可觀察結(jié)果，檢測(cè)限為10 fg/μL，將該芯片連接于光學(xué)探測(cè)器即可定量分析。隨后他們將樣品DNA快速提取也整合于同一塊芯片上，根據(jù)綠色熒光肉眼觀察結(jié)果[37]。Zhu等[38]研發(fā)了一種無(wú)需動(dòng)力裝置的自吸離散式微流控芯片，用于數(shù)字LAMP定量檢測(cè)。該芯片有4個(gè)獨(dú)立的面板，每個(gè)面板上有1 200個(gè)獨(dú)立的6 nl的小室，可同時(shí)對(duì)4個(gè)樣本準(zhǔn)確定量。Zhou等[39]研發(fā)了一種整合了實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)的微流體芯片，能同時(shí)檢測(cè)10種病原細(xì)菌。Luo等[40]將LAMP反應(yīng)整合于激光蝕刻的銦錫氧化物電極的多元微流體芯片，成功的檢測(cè)了上呼吸道感染細(xì)菌。臺(tái)灣也有一些此方面的研究。Wang等[41]將樣品DNA制備和LAMP反應(yīng)整合于微流體芯片上，利用光度計(jì)檢測(cè)光學(xué)密度可進(jìn)行半定量分析，采用該芯片檢測(cè)MRSA，檢測(cè)限約10 fg/μL。Chang等先后研發(fā)了檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的微流體芯片系統(tǒng)及檢測(cè)新鮮蘭花葉片中病毒的微流體芯片系統(tǒng)，均整合了核酸提取、LAMP及濁度檢測(cè)于同一塊芯片上[42-43]。Lin等[44]也研發(fā)了整合了病毒RNA純化和RT-LAMP反應(yīng)及埋式光纖檢測(cè)的的微流體芯片系統(tǒng)，用以檢測(cè)蘭花病原體。

國(guó)外研究者也致力于整合LAMP反應(yīng)于微流體芯片上。Tourlousse等[45]研發(fā)了一種一次性的微流體芯片，可整合實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)，利用該芯片20 min內(nèi)成功的定量檢測(cè)了多種病原菌，靈敏度達(dá)到10～100拷貝基因組/μL。Stedtfeld等[46]研發(fā)了一款整合了LAMP反應(yīng)的微流體芯片檢測(cè)裝置Gene-Z，可同時(shí)檢測(cè)4個(gè)樣本，通過(guò)WIFI連接在智能手機(jī)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。該裝置商業(yè)成本不超過(guò)1 000美元，一次性的芯片成本約2～10美元。Sun等[47]研制了整合樣品制備與LAMP反應(yīng)的多通道的微流控芯片系統(tǒng)，快速實(shí)時(shí)定量檢測(cè)食物樣品中的沙門(mén)氏菌（Salmonella spp.）。

2.4 結(jié)合生物傳感器技術(shù)

生物傳感器，是一種對(duì)生物物質(zhì)（核酸、抗原、酶、細(xì)胞等）敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。目前在食品分析、生物醫(yī)學(xué)、臨床檢驗(yàn)、環(huán)境檢測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用前景。生物傳感器通常與微流體芯片聯(lián)合應(yīng)用到LAMP技術(shù)中，快速高效、集成化、自動(dòng)化和高通量的檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。Nakamura等[48]利用電化學(xué)DNA芯片結(jié)合LAMP檢測(cè)了6個(gè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的SNP多態(tài)性。Ahmed等[49]研發(fā)了一種利用電化學(xué)基因傳感器快速分析LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的簡(jiǎn)易裝置DNA stick（DS），成功的檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因玉米CBH 351，檢測(cè)限是3×102 拷貝/反應(yīng)。該裝置分LAMP反應(yīng)層和含染料與電化學(xué)印刷（DEP）芯片的檢測(cè)層，中間以混合閥隔開(kāi)；LAMP反應(yīng)完后，破壞混合閥混合擴(kuò)增產(chǎn)物和熒光染料H33258，然后顛倒裝置，使混合物浸入到連接了電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備的DEP芯片，通過(guò)陽(yáng)極電流信號(hào)的降低來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。之后他們又利用LAMP結(jié)合電化學(xué)基因傳感器成功鑒定了食品原料和加工品中肉的種類(lèi)[50]。Sun等[51]采用基于碳離子液體電極的電化學(xué)DNA傳感器結(jié)合LAMP技術(shù)成功的檢測(cè)了豬肉中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）。Patterson等[52]整合了LAMP及電化學(xué)DNA傳感器于手提式微流體芯片系統(tǒng)上，檢測(cè)來(lái)源于膿毒癥小鼠的全血樣中的沙門(mén)氏菌及血清型種內(nèi)區(qū)分。Zhi等[53]首次制造了新穎的整合LAMP、線(xiàn)性探針雜交法和巨磁電阻傳感器的微流控芯片系統(tǒng)，用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因分型。Xie等[54]利用電化學(xué)適體生物傳感器結(jié)合LAMP技術(shù)靈敏的檢測(cè)赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，已廣泛地應(yīng)用在食品[55]、環(huán)境[56]、醫(yī)學(xué)[57]等方面的快速檢測(cè)。LAMP在轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)方面的應(yīng)用也越來(lái)越多，如外源基因的檢測(cè)及轉(zhuǎn)化事件檢測(cè)，主要作物有玉米、大豆、水稻、油菜等。

3.1 外源基因

CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、抗蟲(chóng)基因和抗除草劑基因Cp4-epsps是轉(zhuǎn)基因植物中使用較多的外源基因，常用于轉(zhuǎn)基因成分的初步篩選。Fukuta等[58]建立了CaMV35S啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)濁度LAMP檢測(cè)方法，用此方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready中的CaMV35S啟動(dòng)子，檢測(cè)限為0.5%。熊槐等[59]將LAMP反應(yīng)液和SYBR Green I在反應(yīng)前同時(shí)置于特殊設(shè)計(jì)的HF反應(yīng)管中，實(shí)現(xiàn)了閉管檢測(cè)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行了檢測(cè)。王永等[60]建立了轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S啟動(dòng)子的LAMP檢測(cè)方法，靈敏度是常規(guī)PCR的10倍，并應(yīng)用該方法對(duì)7種轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行了CaMV35S啟動(dòng)子檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確。李向麗等[61]建立了食用植物油中的CaMV35S啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)濁度LAMP檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)0.01%。鄺筱珊等[62]建立了一種檢測(cè)食品和飼料中FMV35S啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)濁度LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.5%。蘭青闊等[63]建立了針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆Cp4-epsps基因的LAMP 檢測(cè)方法，65 ℃反應(yīng)30 min即可，檢測(cè)限為0.005%。劉彩霞等[64]和袁瑛娜等[65]也分別建立了Cp4-epsps基因的LAMP 檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.01%。周琳華等[66]建立了cry1Ab抗蟲(chóng)基因LAMP檢測(cè)方法，以質(zhì)粒為模板時(shí)靈敏度達(dá)20拷貝/μL。對(duì)市售的玉米面、玉米粉、甜玉米、米粉等進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果與SYBR Green I熒光PCR法一致。Li等[67]也建立了cry1Ab基因的LAMP檢測(cè)方法。其他研究者也建立了cry1Ac、cry2Ab和cry3A的LAMP檢測(cè)方法[68-69]。Randhawa等[70]建立了啟動(dòng)子（CaMV35S和FMV35S啟動(dòng)子）和標(biāo)記基因（aadA、nptII和uidA）的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法，最低檢測(cè)到4拷貝基因組DNA。Feng等[71]建立了7種外源基因（CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTII、PAT、Bar、FMV35S啟動(dòng)子和Gox）的LAMP檢測(cè)方法，均能檢測(cè)到0.5%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。此外，抗除草劑pat基因[72]、轉(zhuǎn)基因玉米LY038外源cordapA基因[73]及轉(zhuǎn)基因玉米BVLA430101植酸酶（phytase）基因[74]也均建立了相應(yīng)的LAMP檢測(cè)方法。

3.2 品系檢測(cè)

我國(guó)已經(jīng)獲得安全應(yīng)用的生產(chǎn)證書(shū)的作物有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101、水稻（華恢1號(hào)和Bt汕優(yōu)63）和棉花，獲得進(jìn)口安全證書(shū)的有棉花、大豆、玉米、油菜4種轉(zhuǎn)基因作物用于加工原料。在通過(guò)外源基因檢測(cè)初步篩查出含轉(zhuǎn)基因成分的作物或加工品后，有必要對(duì)其所含轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)一步檢測(cè)。

3.2.1 玉米 目前我國(guó)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米主要用于飼料加工，LAMP方法在轉(zhuǎn)基因玉米品系的快速檢測(cè)方面的應(yīng)用很多。Chen等[75]建立了7種轉(zhuǎn)基因玉米（DAS-59122-7，T25，BT176，TC1507，MON810，BT11和MON863）的LAMP 快速檢測(cè)方法，采用SYBR Green I染色，檢測(cè)時(shí)間在40 min內(nèi)，除MON810的檢測(cè)限是40拷貝基因組DNA外，其他6種轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)限均為4 拷貝基因組DNA。蘭青闊等[76]建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON863的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.01%；Huang等[77]也建立了MON863的熒光定性和定量LAMP 檢測(cè)方法，檢測(cè)限為4拷貝基因組DNA。張雋等[78]建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON89034的LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)1 pg。凌莉等[79]建立了轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.5%，特異性和穩(wěn)定性均達(dá)到100%。王小玉等[80]建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON810的LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.5%。此外，其他研究者也建立了轉(zhuǎn)基因玉米Bt11[81-82]、Bt176[83]、T25[84]、GA21[85]品系的LAMP檢測(cè)方法。

3.2.2 大豆 中國(guó)每年都進(jìn)口大量轉(zhuǎn)基因大豆用于食用油及其他豆制品的加工原料，因此轉(zhuǎn)基因大豆的快速靈敏的檢測(cè)方法必不可少。Guan等[86]根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和MON89788的3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列分別設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了GTS40-3-2和MON89788品系的LAMP檢測(cè)方法，采用熒光染料染色，40 min內(nèi)完成檢測(cè)，檢測(cè)限均為0.005%。劉津等[87]也根據(jù)GTS40-3-2的3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)計(jì)LAMP引物，利用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了GTS40-3-2品系的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.5%。王永等[88]則根據(jù)GTS40-3-2的5′端轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了GTS40-3-2 轉(zhuǎn)化體特異性成分的LAMP檢測(cè)方法，利用鈣黃綠素染料觀察結(jié)果，檢測(cè)限為0.001%，是普通PCR方法的10倍。蔡穎等[89]和邵碧英等[90]分別建立了轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127和A2704-12品系的LAMP 檢測(cè)方法，檢測(cè)限均達(dá)到0.1%。

3.2.3 水稻 我國(guó)尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的生產(chǎn)許可，但市面上及出口大米卻屢次檢出含轉(zhuǎn)基因成分。為了加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的種植管理及種子非法生產(chǎn)銷(xiāo)售的監(jiān)管，建立快速靈敏的轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)方法至關(guān)重要，目前針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)和Bt63品系的LAMP檢測(cè)方法均有報(bào)道。Chen等[91]建立了3種轉(zhuǎn)Bt水稻（KMD1，TT51-1和KF6）的LAMP檢測(cè)方法，分別采用兩種染料SYBR Green I和HNB染色及凝膠電泳觀察反應(yīng)結(jié)果，KMD1和TT51-1的檢測(cè)限為0.01%，KF6的檢測(cè)限為0.005%，靈敏度較普通PCR高10～100倍。吳少云等[92]建立了轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系的實(shí)時(shí)濁度LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.01%；用該方法對(duì)市面上的24份大米樣品進(jìn)行Bt63品系成分檢測(cè)，檢出2份陽(yáng)性，與熒光PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。張明哲等[93]也建立了轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系的LAMP檢測(cè)方法，靈敏度均達(dá)0.01%。Chen等[94]建立了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的LAMP可視化檢測(cè)方法，檢測(cè)限為20拷貝基因組DNA，比傳統(tǒng)PCR靈敏10倍。

3.2.4 其他 除了玉米、水稻和大豆等作物外，還有一些其他轉(zhuǎn)基因植物也建立了相應(yīng)的LAMP檢測(cè)方法。Rostamkhani等[95]用LAMP法快速鑒定了轉(zhuǎn)基因棉花中的chitinase（chi）and cry1A（b）基因，與傳統(tǒng)PCR法進(jìn)行了比較，LAMP法的檢測(cè)限為稀釋至10-8的模板DNA，為傳統(tǒng)PCR的100倍。Zhou等[96]建立了轉(zhuǎn)基因甘蔗中cry1Ac基因的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為43.1拷貝質(zhì)粒，1.0 ng/μL甘蔗基因組DNA。Cheng等[97]建立了轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1的LAMP檢測(cè)方法，38 min內(nèi)完成擴(kuò)增，靈敏度為0.1%，相當(dāng)于6拷貝小麥基因組DNA。劉二龍等建立了轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系和J101品系的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)限為16 pg，相當(dāng)于10 拷貝苜蓿草基因組DNA[98-99]。

4 展望

雖然LAMP技術(shù)反應(yīng)快速，設(shè)備簡(jiǎn)單，結(jié)果肉眼可見(jiàn)；但是，植物基因組DNA的提取仍需要昂貴的高速離心機(jī)等儀器，耗時(shí)也較長(zhǎng)，這直接影響了LAMP技術(shù)在田間或基層檢測(cè)的推廣應(yīng)用。Kaneko等[100]發(fā)現(xiàn)LAMP對(duì)MEM培養(yǎng)基和幾種生物制品（鹽、PBS、血清、血漿等）具有較強(qiáng)的耐受性。因此，可以開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速的DNA提取方法，進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，使LAMP技術(shù)更適合在田間或基層檢測(cè)的應(yīng)用。Zhang等[101]開(kāi)發(fā)了一種新穎的適用于田間快速篩選和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)系統(tǒng)。該檢測(cè)系統(tǒng)由一個(gè)DNA提取裝置結(jié)合改良的可視化LAMP技術(shù)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。DNA提取裝置主要含有一個(gè)硅膠膜過(guò)濾柱和改良的注射器，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，可用于田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。利用該裝置15 min內(nèi)就能從植物組織提取出高質(zhì)量的基因組DNA，利用該系統(tǒng)成功的檢測(cè)了多種轉(zhuǎn)基因作物。

此外，LAMP法的終點(diǎn)觀察結(jié)果不能排除非特異性擴(kuò)增，因此將LAMP結(jié)合橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)可以很好的解決這個(gè)問(wèn)題，試紙條法可以特異性指示目的擴(kuò)增條帶，簡(jiǎn)單快速，適合于田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

LAMP 技術(shù)無(wú)需專(zhuān)用儀器，僅需水浴鍋或加熱塊，成本低，耗時(shí)僅30～60 min，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，特異性好，重復(fù)性好，靈敏度高，無(wú)需經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，尤其適合基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，或現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，是一項(xiàng)可以普及推廣的檢測(cè)技術(shù)。隨著各種商品化專(zhuān)用儀器及試劑盒的出現(xiàn)，LAMP的操作越發(fā)簡(jiǎn)單化，如電池驅(qū)動(dòng)的恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀器，僅重1 kg，可以實(shí)時(shí)觀測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，非常適合田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。2014年我國(guó)頒布了轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆及油菜的多個(gè)品系的LAMP檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，意味著LAMP技術(shù)在我國(guó)正式應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)中，未來(lái)LAMP技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的檢測(cè)方面將有良好的應(yīng)用前景。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)