粗皮桉種源遺傳多樣性SSR分析

李昌榮 熊濤 陳東林 鄧紫宇 陳升侃 藍必布 梁建新 蘭俊

摘要：【目的】分析粗皮桉的親緣關系及遺傳多樣性，為其種質資源利用及分子育種提供參考?！痉椒ā恳源制よ?個種源（種源1～7）75株樣品為材料，基于覆蓋巨桉全基因組的21個SSR標記，利用SSR位點、種源遺傳分化及種源間遺傳距離等分析粗皮桉群體遺傳多樣性?！窘Y果】21對引物共擴增出252個等位基因（平均每個SSR引物擴增出12個），平均有效等位基因數(shù)（Ne）為4.5788，平均期望雜合度（HE）為0.7227，平均基因多樣性（H）為0.7179，平均Shannon信息指數(shù)（I）為1.7150。7個種源的遺傳多樣性參數(shù)存在差異，其中種源3的遺傳多樣性參數(shù)最高。群體間的基因分化系數(shù)（FST）為0.0965，即9.65%的遺傳變異存在于種源間，90.35%存在種源內。7個種源的遺傳距離變化范圍為0.0965～0.3188，平均為0.2061，聚類分析結果表明，當閥值為0.82時，7個種源被分為昆士蘭北部種源和巴布亞新幾內亞種源兩大類；當閥值為0.84時，昆士蘭北部的4個種源被進一步分為兩大亞類，種源間遺傳距離與種源的地理分布密切相關?！窘Y論】粗皮桉7個種源存在較豐富的遺傳多樣性，適于開展長周期、多世代改良工作。

關鍵詞： 粗皮桉；SSR標記；遺傳多樣性

中圖分類號： S792.39 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0007-06

Analysis on genetic diversity of Eucalyptus pellita

based on SSR markers

LI Chang-rong 1， XIONG Tao2， CHEN Dong-lin2， DENG Zi-yu1， CHEN Sheng-kan3，

LAN Bi-bu4， LIANG Jian-xin4， LAN Jun2 *

（1 Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation / Guangxi Forestry Research Institute， Nanning 530002， China； 2 Guangxi Dongmen Forestry Farm， Fusui， Guangxi 532108， China； 3 Forestry College， Guangxi

University， Nanning 530004， China； 4 Guangxi Daguishan Forestry Farm， Hezhou， Guangxi 542800， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity and relationship of Eucalyptus pellita were analyzed， in order to provide references for germplasm resources utilization and molecular breeding. 【Method】A total of 75 samples were collected from seven E. pellita provenances. Then the SSR loci， genetic differentiation and genetic distance between provenances of these samples were studied to understand their genetic diversity based on 21 SSR markers of Eucalyptus grandis genome. 【Result】The results showed that， using 21 SSR primers， a total of 252 alleles were amplified from samples（with an average of 12 alleles per SSR primer）， the average number of effective alleles（Ne） was 4.5788， the average expected heterozygosity（HE） was 0.7227， the average gene diversity（H） was 0.7179， and the average Shannons information index（I） was 1.7150. Furthermore， there existed differences in genetic diversity parameters between 7 provenances， and the provenance 3 had the highest genetic diversity parameter. The average coefficient of genetic differentiation between populations（FST） was 0.0965， it indicated that there occurred 9.65% genetic variation among provenances and 90.35% within provenance. Moreover， the genetic distances varied from 0.0965 to 0.3188， with an average of 0.2061. The cluster analysis showed that when genetic identity threshold was 0.82， the seven provenances could be clustered into two branches， four north Queensland provenances belonged to branch 1 and three Papua New Guinea provenances belonged to branch 2； when genetic identity threshold was 0.84， the four north Queensland provenances were clustered into two subbranches， it suggested that the genetic distances between provenances closely related to geographical distribution of provenances. 【Conclusion】The seven provenances of E. pellita have high genetic diversity， which are suitable for long-term research of multi-generational improvement.

Key words： E. pellita； SSR marker； genetic diversity

0 引言

【研究意義】粗皮桉（Eucalyptus pellita）是重要的用材樹種和優(yōu)良的水源涵養(yǎng)樹種，其木材呈紅色至深紅色，材質堅硬，可作枕木及建筑、造船和家具等用材，其雜種優(yōu)勢強，是桉樹種間雜交的重要育種材料（祁述雄，2002）。目前，我國粗皮桉還處于引種改良階段，在分子水平上對其群體結構和遺傳多樣性的研究尚未展開，無法合理選擇利用和建立其第二代育種群體。因此，開展粗皮桉種源遺傳多樣性SSR分析，對粗皮桉種質資源利用及育種策略制定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】粗皮桉天然分布于澳大利亞北部和巴布亞新幾內亞，在澳大利亞主要有昆士蘭北部和新南威爾士兩個間斷的分布區(qū)（王豁然，2010）。粗皮桉喜夏雨型氣候，在西薩摩亞和巴西已成功引種（Woods and Peseta，1996；Harwood et al.，1997），印度尼西亞已進行了二代種子園研究（Leksono et al.，2008）。我國從20世紀80年代開始引種粗皮桉，在廣西（Pegg and Wang，1994）、海南（吳坤明和吳菊英，1988）、廣東（陳文平等，2001；廖柏勇等，2011）及福建（林玉清，2010）等地表現(xiàn)出較好的速生性和適應性。SSR標記作為第二代DNA分子標記（劉果和謝耀堅，2012），具有多態(tài)性豐富、重復性高等特點，是研究群體遺傳多樣性的理想標記之一（Plaschke et al.，1995；Struss and Plieske，1998），已被應用于桉樹雜種優(yōu)勢預測（何旭東，2010）、遺傳圖譜構建（李發(fā)根，2010）、巨桉抗枝癭姬小蜂關聯(lián)分析（張苗苗等，2012）及大花序桉群體遺傳結構分析（鄧紫宇，2012），結果表明，桉樹雜交親本多態(tài)性較好，用單一性狀預測雜種優(yōu)勢可能具有一定風險；構建了具有一定密度和精度的桉樹遺傳圖譜，檢查到6個控制樹高的QTL，3個控制胸徑的QTL，5個控制單株材積的QTL；發(fā)現(xiàn)一個SSR標記與抗枝癭姬小蜂顯著相關，對抗性的決定系數(shù)達0.4436；大花序桉遺傳多樣性豐富，20.65%的遺傳變異存在于種源之間，79.35%的遺傳變異存在于種源內?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對粗皮桉的研究主要集中在引種、材性等方面，在分子水平上的研究仍處于起步階段，對其群體遺傳結構和遺傳多樣性研究未見報道?！緮M解決的關鍵問題】以粗皮桉7個種源為材料，利用SSR標記分析其遺傳多樣性及其親緣關系，以期為粗皮桉遺傳資源的保存、評價及利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

粗皮桉7個種源（75個家系）材料均來源于1989年在廣西國有東門林場雷卡分場建立的粗皮桉種源/家系試驗林，其中4個為昆士蘭北部種源，3個為巴布亞新幾內亞種源。種源1～7信息詳見表1。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 總DNA提取及SSR引物篩選 每個粗皮桉家系選取1株平均木采集葉樣，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取粗皮桉總DNA。

從Brondani等（2006）和周長品（2011）發(fā)布的SSR引物中挑選50對引物進行復篩，選出多態(tài)性豐富、重復性好的21對引物用于正式擴增。SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 2 SSR引物擴增 PCR反應體系、擴增條件和標記分型參考李發(fā)根（2012）的dUTP法。10.00 μL反應體系包括10×緩沖液、25 μmol/L dNTP、引物、1.5或2.0 mmol/L MgCl2、10 pmol熒光dUTP、1 U Taq DNA聚合酶（申能博彩生物科技有限公司）及10 ng DNA模板。擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s（每循環(huán)降溫0.5 ℃），72 ℃ 1 min，進行20個循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行26個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

在ABI 3130xl測序儀上進行標記分型，取2.00 μL PCR產(chǎn)物、0.16 μL GeneScan 500 LIZ內標、7.84 μL高純甲酰胺混勻，95 ℃變性5 min、迅速冰浴，按測序儀操作手冊說明檢測樣品。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

利用GenAlEx 6.4.1計算等位基因數(shù)（NA）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（HO）、期望雜合度（HE）、Nei基因多樣性（H）、Shannon信息指數(shù)（I）。

利用FSTAT 2.9.3.2計算群體間分化系數(shù)（FST），再計算基因流。

基因流（Nm）=0.25×（1-FST）/FST

利用NTSYSpc 2.1軟件構建親緣關系進化樹。

2 結果與分析

2. 1 SSR位點的多樣性

圖1為引物SSR349 4個樣品的分型結果，共包含3個等位基因及3種不同基因型，其中3個為雜合子、1個為純合子，多態(tài)性含量較高。由表2可知，21對SSR引物共檢測到252個等位基因，NA變化范圍為4～23個，平均每個位點NA為12個。其中，引物EMBRA269擴增出NA最多，為23個；引物EUCeSSR162擴增出NA最少，僅4個。Ne的變化范圍從位點EUCeSSR299到位點EMBRA269為1.8835～10.7553，平均為4.5788。

從圖1和表2可以看出，21對SSR引物多樣性信息量存在差異，I平均值為1.7150，變化范圍為0.9973～ 2.6522。Ho變化范圍從位點EST-SSR546到位點EUCeSSR345為0.2400～0.9867，平均為0.5151。HE的變化范圍從位點EUCeSSR299到位點EMBRA269為0.4722～0.9131，平均為0.7227。H變化范圍從位點EMBRA303到位點EMBRA269為0.5392～0.9070，平均為0.7179。

由表3可知，粗皮桉7個種源的NA、Ne、I、Ho、HE及H等參數(shù)均存在差異。其中，種源3的各項參數(shù)均最高，種源4的NA最少，種源7的Ne、I、HE和H均最低，種源6的Ho最低。

2. 2 種源的遺傳分化

由表2可知，不同位點的FST變化較明顯，其中位點EUCeSSR345的FST最小，為0.0194，位點EST-SSR546的FST最大，為0.2222，平均值較小，為0.0965，即只有9.65%的遺傳變異存在于種源間，90.35%的遺傳變異發(fā)生在種源內，說明各種源間的遺傳分化程度較低：Nm平均值為2.9902，說明粗皮桉種源間存在較高程度的基因交流。

2. 3 種源間的遺傳距離與遺傳一致度

由表4可知，粗皮桉7個種源的遺傳一致度為0.7271～0.9080，遺傳一致度最大的兩個種源為種源5和種源6，相似度達0.9080，兩個種源的地理位置、海拔均非常接近，基因交流程度高；遺傳一致度最小的是種源1和種源6，平均遺傳一致度為0.7271。7個種源間的遺傳距離為0.0965～0.3188，平均遺傳距離為0.2061，遺傳距離最遠的兩個種源是種源1與種源6，遺傳距離最近的是種源5與種源6。

2. 4 聚類分析結果

根據(jù)粗皮桉種源間的遺傳距離按照UPGMA方法進行聚類，構建7個種源間的親緣關系進化樹（圖2）。當距離閥值為0.82時，7個種源被分為兩大類，第一類為種源1、種源2、種源3和種源7，第二類為種源4、種源5和種源6。此聚類與各種源的地理位置存在明顯相關性，準確性較高，第一類的4個種源均為昆士蘭北部種源，第二類的3個種源為巴布亞新幾內亞種源。昆士蘭北部種源與巴布亞新幾內亞種源被托列斯海峽相隔，彼此間地理相隔遠，其地理上的隔離使兩個分布區(qū)種源間基因交流程度小，導致出現(xiàn)一定的遺傳分化，遺傳距離遠，因此在分類圖上被分開；地理位置相隔較近的昆士蘭北部種源（種源1、種源2、種源3和種源7）間及巴布亞新幾內亞內的種源（種源4、種源5和種源6）間由于地理位置相近、海拔相似，便于花粉利用風媒蟲媒等在各種源間傳播，便于基因交流，遺傳距離近，因此這類種源被分為同一類。

當距離閥值為0.84時，7個種源被分為三大類，第一類為種源1和種源7，第二類為種源2和種源3，第三類為種源4、種源5和種源6。此分類將昆士蘭北部的4個種源分為兩類，將巴布亞新幾內亞的3個種源分為一類，昆士蘭北部種源間的遺傳分化大于巴布亞新幾內亞種源。

當距離閥值為0.88時，7個種源被分為五大類，種源1、種源4和種源7各為一類，種源2和種源3為一類，種源5和種源6為一類。昆士蘭北部的4個種源中，種源2和種源3的遺傳距離較近；巴布亞新幾內亞的3個種源中，種源5和種源6的遺傳距離最近，為所有種源中遺傳距離最近的一組。

3 討論

3. 1 粗皮桉的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，林木遺傳多樣性的豐富度決定著樹種對各種環(huán)境的適應能力、對不良極端環(huán)境的抵御能力及被改造利用的潛力，是林木遺傳改良的基礎。粗皮桉的I為1.7150，H為0.7179，均小于大花序桉（I=2.1207，H=0.8196）（鄧紫宇，2012），但高于馬尾松無性系種子園子代（I=1.0156，H=0.4823）（王鵬良，2006）和杉木第1代遺傳改良收集的育種群體（I=0.9800，H=0.5000）（歐陽磊等，2014），說明粗皮桉育種群體遺傳多樣性較高，適于開展長周期、多世代改良工作。

本研究中，NA、Ne、I、HE和H等參數(shù)均以種源3最高，種源2次之，原因與粗皮桉的分布位置有關。王豁然（2010）研究認為，粗皮桉有兩個分布中心，即昆士蘭北部和新南威爾士，而本研究中的種源2和種源3處于昆士蘭北部半島中間地帶，處于分布中心內，故其遺傳多樣性均高于其他種源。

3. 2 粗皮桉的基因流和遺傳分化

Wright（1931）研究認為，群體間的遺傳差異受Nm影響很大，Nm大于1時能阻止或延緩由漂變引起的遺傳差異。粗皮桉Nm的平均值達2.9902，有較高水平的基因交流，能防止因遺傳漂變等因素引起的群體間遺傳分化。

從分布范圍來看，粗皮桉的FST均小于Hamrick等（1990）所總結的特有種、狹域種、地區(qū)種及廣布種4種分布類型植物，粗皮桉為廣布種，7個種源中的4個種源為澳大利亞昆士蘭北部種源，3個為巴布亞新幾內亞種源，被托列斯海峽所分隔，但這兩大種源區(qū)內的種源基因交流頻繁，使得各種源間的遺傳分化較小。從生活類型上看，粗皮桉為多年生長壽命物種，其FST遠小于草本植物，而與多年生木本植物相差不明顯。從交配系統(tǒng)上看，粗皮桉的花粉成熟期比柱頭的最佳授粉時間略早，以異交為主，但也存在很多自交現(xiàn)象，可通過風媒傳播花粉或種子，也可以通過昆蟲等動物來傳播花粉或種子，屬于風媒蟲媒混合型混交植物，花粉較小，傳播范圍廣，傳播途徑多樣，所有這些因素均能使粗皮桉種源間具有較高的基因交流程度，從而使其遺傳分化較小。

本研究結果顯示，粗皮桉遺傳變異主要集中在種源內。因此，今后在粗皮桉遺傳改良過程中，要充分利用種源內的變異，同時應通過種間雜交等方式創(chuàng)造新的變異并加以利用。

3. 3 粗皮桉種質資源的保護和利用

目前，南方桉樹速生豐產(chǎn)林所生產(chǎn)的木材主要用于造紙、旋切板等，用于鋸材生產(chǎn)的桉樹樹種不多。由于粗皮桉具有良好的木材性質，作為鋸材生產(chǎn)潛力樹種之一對桉樹產(chǎn)業(yè)升級具有重要作用，因此，做好粗皮桉種質資源保護和利用工作顯得尤為重要。粗皮桉具有豐富的遺傳多樣性，其遺傳變異90.35%存在于種源內，在保護種質資源時應充分重視種源內不同類型個體的保存，同時要防止人為因素對種質資源造成破壞。

在林木遺傳改良工作中不斷補充新的種質資源，可提高育種群體的遺傳變異，有利于開展遺傳改良工作。本研究中的粗皮桉種源/家系來自于昆士蘭北部和巴布亞新幾內亞，缺少新南威爾士的種源，在下一步的種質資源引進工作中，應當重點引進新南威爾士粗皮桉種源，以增加育種群體的遺傳多樣性，提高創(chuàng)造更高產(chǎn)優(yōu)質新品種的潛力。

目前，對雜種優(yōu)勢與遺傳距離的正負相關問題仍有爭論。張愛民（1994）研究認為，在一定范圍內，雜種優(yōu)勢的大小主要取決于雙親的遺傳差異和性狀的互補，差異越大，其后代的雜種優(yōu)勢就越大。本研究結果表明，粗皮桉存在較大的遺傳變異，從中選出遺傳差異較大的親本進行雜交育種具有可行性，因此，在雜交育種過程中，在親本選配時應同時兼顧親本間遺傳距離和親本的遺傳組成，盡可能選擇遺傳距離大的親本進行雜交。

4 結論

本研究結果表明，粗皮桉7個種源間存在豐富的遺傳多樣性，適于開展長周期、多世代改良工作。

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（責任編輯 思利華）

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