都柳江鲇形目兩種經(jīng)濟(jì)魚類種群Cyt b基因的遺傳多樣性分析

劉偉 代應(yīng)貴 袁振興 范家佑

摘要：【目的】研究分析貴州都柳江鲇、斑鳠種群細(xì)胞色素b基因（Cyt b）的遺傳多樣性，為都柳江鲇形目經(jīng)濟(jì)魚類資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。【方法】以PCR擴(kuò)增都柳江鲇、斑鳠種群的Cyt b基因序列，經(jīng)雙向測序、拼接后采用相關(guān)在線軟件進(jìn)行序列變異及遺傳多樣性分析。【結(jié)果】都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列均為1122 bp，分別檢測到46和15個變異位點(diǎn)，對應(yīng)定義為11個單倍型（NHap1～NHap11）和10個單倍型（BHap1～BHap10）。都柳江鲇、斑鳠種群的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.646、0.00899和0.610、0.00101。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列均編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸，以亮氨酸平均含量最高（17.65%和16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.80%和0.78%）。4種堿基在這兩種魚類Cyt b基因密碼子第1位點(diǎn)上出現(xiàn)頻率約等，在第2、3位點(diǎn)上的出現(xiàn)頻率則存在明顯差異。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因密碼子第3位點(diǎn)上的變異頻率顯著高于第1和第2位點(diǎn)，但第3位點(diǎn)上的變異多為同義突變?！窘Y(jié)論】都柳江鲇種群大小穩(wěn)定，具有較豐富的遺傳多樣性；都柳江斑鳠種群遺傳多樣性較匱乏，可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和種群擴(kuò)張事件，急需開展種群保護(hù)和恢復(fù)工作。

關(guān)鍵詞： 鲇；斑鳠；Cyt b基因；遺傳多樣性；都柳江

中圖分類號： S917；Q959.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1766-06

0 引言

【研究意義】鲇（Silurus asotus）、斑鳠（Hemibagrus guttatus）為我國重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類，分別隸屬于鲇形目（Siluriformes）的鲇科（Siluridae）和鲿科（Bagridae）。鲇在我國各大水系均有分布（除新疆和西藏外）；斑鳠主要分布于錢塘江、九龍江和珠江等水系（褚新洛等，1999），因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、無肌間刺等優(yōu)點(diǎn)，被視為珠江四大名魚之一（陳焜慈等，1999）。都柳江位于貴州境內(nèi)，為珠江水系西江中游支流——柳江的源流。近年來，因鲇和斑鳠的市場需求量不斷增大，在都柳江受到高強(qiáng)度捕撈，其野生資源遭受嚴(yán)重破壞。因此，深入研究都柳江鲇、斑鳠種群遺傳多樣性及其分布現(xiàn)狀，對開展這兩種魚類野生種群資源的利用與保護(hù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DNA分子標(biāo)記是魚類遺傳多樣性研究的有效手段（Liu and Cordes，2004），可為制定魚類種質(zhì)資源的利用與保護(hù)策略提供參考依據(jù)。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）為核外基因，具有母系遺傳的特點(diǎn)，因其復(fù)制過程中缺乏修復(fù)機(jī)制而導(dǎo)致其序列的累積變異速率遠(yuǎn)高于核基因組的變異速率，現(xiàn)已成為群體遺傳學(xué)研究中的理想分子標(biāo)記（Saccone et al.，1991）。細(xì)胞色素b基因（Cyt b）是mtDNA中結(jié)構(gòu)和功能研究較清楚的編碼基因之一，其進(jìn)化速度適中，適用于種群遺傳多樣性檢測，現(xiàn)已在魚類種群遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用（Meyer and Wilson，1990；徐宇等，2015）。杜民等（2009）基于Cyt b基因序列探討我國南海裸胸鱔屬（Gymnothorax）魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除蠕紋裸胸鱔（Gymnothorax kidako）來源于日本海外，其余5種裸胸鱔均來源于我國南海，但彼此間并無明顯的地域差異。肖明松等（2013）對淮河鲇的7個野生種群Cyt b基因進(jìn)行測定，結(jié)果表明，淮河鲇野生種群的遺傳多樣性較高，且各種群間未發(fā)生明顯的地理分化。鐘立強(qiáng)等（2013）對長江中下游5個湖泊的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）種群Cyt b基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，5個群體間遺傳分化系數(shù)Fst為0.0684，幾乎所有變異均來自群體內(nèi)，群體間遺傳分化極小，即長江中下游不同黃顙魚種群尚未分化成不同的分支譜系，種群間存在廣泛的基因交流。徐丹丹（2013）對鲇的長江、珠江、遼河及東南沿海等8個不同地理種群Cyt b基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這8個地理種群尚保存著較豐富的遺傳多樣性。李大命等（2015）以Cyt b為分子標(biāo)記對太湖大銀魚（Protosalanx chinensis）野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明太湖大銀魚種群穩(wěn)定，尚未經(jīng)歷種群擴(kuò)張?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，貴州都柳江鲇、斑鳠野生資源正遭受過度捕撈，開展其野生種群保護(hù)及種質(zhì)資源遺傳多樣性評估十分迫切，但至今鮮見有關(guān)貴州都柳江鲇、斑鳠野生種群遺傳多樣性的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對貴州都柳江鲇、斑鳠的Cyt b基因序列進(jìn)行測定分析，研究其種群的遺傳多樣性，為都柳江鲇形目經(jīng)濟(jì)魚類的資源保護(hù)和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

于都柳江干流上、中、下游的獨(dú)山、三都、榕江和從江分別收集野生鲇、斑鳠各39尾鮮活個體。每尾活魚取背部肌肉3.0～5.0 g，以無水乙醇固定后及時帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 DNA提取

采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒，參照其說明從肌肉樣品提取基因組DNA。DNA的質(zhì)量和純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 Cyt b基因擴(kuò)增與測序

用于擴(kuò)增鲇、斑鳠Cyt b基因片段的引物為通用引物L(fēng)14724（5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'）和H15915（5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'）（Xiao et al.，2001），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，包括2×Ex Taq Bufffer 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序參照肖明松等（2013）的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將電泳條帶清晰、明亮且單一的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序、拼接，測序引物為擴(kuò)增引物。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

序列輸入ClustalX 2.1進(jìn)行比對分析，輔以人工校對，獲取長度相同的同源序列用于種群遺傳多樣性分析。用DnsSP 5.10計算遺傳多樣性參數(shù)，采用MEGA 5.0分析序列堿基含量及Kimura 2-parameter遺傳距離，并將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。分別以大口鲇（Silurus meridionalis）Cyt b基因的同源序列（登錄號JX087350.1）、大鰭鳠（Hemibagrus macropterus）Cyt b基因的同源序列（登錄號JF834542.1）為外類群，構(gòu)建鲇、斑鳠單倍型的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。同時采用Arlequin Ver. 3.01進(jìn)行都柳江鲇、斑鳠種群的Tajimas D中性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因的序列組成及變異情況

PCR擴(kuò)增獲得的都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列長度均為1122 bp，然后分別進(jìn)行遺傳多樣性分析研究。從39個鲇樣本中共檢測出11個單倍型，即NHap1～ NHap11（表1）。其中，NHap2為優(yōu)勢單倍型，其個體數(shù)占總個體數(shù)的58.97%，其次是NHap4，占總個體數(shù)的10.26%。從39個斑鳠樣本中共檢測出10個單倍型，即BHap1～BHap10（表2），其中以BHap2和BHap1為優(yōu)勢單倍型，分別占總個體數(shù)的61.54%和12.82%。

鲇Cyt b基因序列堿基T、C、A、G的平均含量分別為28.4%、29.9%、27.7%和14.0%，且A+T的平均含量（56.1%）明顯高于C+G的平均含量（43.9%），表現(xiàn)出較強(qiáng)的少G偏倚性。鲇Cyt b基因共編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸。其中，亮氨酸的平均含量最高（17.65%），半胱氨酸的平均含量最低（0.80%）。4種堿基在氨基酸密碼子3個位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率存在明顯差異（表3），其中，在密碼子第1位點(diǎn)上無明顯的堿基偏倚性，第2位點(diǎn)上存在明顯的T偏倚和反G偏倚，第3位點(diǎn)上存在反G偏倚且顯示明顯的A和C偏倚。鲇Cyt b基因序列中共檢測到46個變異位點(diǎn)（表1），變異位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)（1122）的4.1%。其中，簡約信息位點(diǎn)38個，單一變異位點(diǎn)8個，未檢測到插入或缺失位點(diǎn)；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)43個（C→T，26個；A→G，17個），顛換位點(diǎn)3個（T→G、C→A及T→A各1個），平均轉(zhuǎn)顛換比為14.33，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)數(shù)明顯多于顛換位點(diǎn)數(shù)。變異位點(diǎn)主要發(fā)生在密碼子第3位點(diǎn)上（35/46），其次是第1位點(diǎn)（8/46）和第2位點(diǎn)（3/46）。

都柳江斑鳠種群Cyt b基因序列亦編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸。20種氨基酸平均含量存在明顯差異，其中以亮氨酸平均含量最高（16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.78%）。斑鳠Cyt b基因序列中堿基T、C、A、G的平均含量分別為31.8%、25.8%、29.3%和13.1%，A+T的平均含量（61.1%）也明顯高于C+G的平均含量（38.9%）。由表3可知，斑鳠4種堿基在其氨基酸密碼子第1、2位點(diǎn)上的分布特征與鲇相似，但在密碼子第3位點(diǎn)上的反G偏倚（2.7%）和A偏倚（42.8%）更明顯。斑鳠Cyt b基因序列存在15個變異位點(diǎn)（表2），變異位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)（1122）的1.34%。其中，單一變異位點(diǎn)12個，簡約信息位點(diǎn)3個，未檢測到插入或缺失位點(diǎn)；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)7個（C→T，2個；A→G，5個），顛換位點(diǎn)8個（C→G，4個；T→A，3個；T→G，1個），平均轉(zhuǎn)顛換比為0.86。變異位點(diǎn)數(shù)在密碼子第3位點(diǎn)上最多（9個），在第1和第2位點(diǎn)上分別有4和2個變異位點(diǎn)。

2. 2 都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因編碼氨基酸序列的變異情況

將都柳江鲇種群Cyt b基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)基于單倍型NHap2編碼的氨基酸序列共檢測到8個氨基酸變異位點(diǎn)。其中，由密碼子第1位點(diǎn)堿基突變引起的氨基酸變異位點(diǎn)有5個，分別是：第11位天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔ˋsn→Asp），第12位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ala→Thr），第93位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔╒al→Ile），第253位脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Pro→Ser），第374位苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸（Phe→Val）。由密碼子第2位點(diǎn)堿基突變引起的氨基酸變異位點(diǎn)有3個，分別是：第19位脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚≒ro→Gln），第322位異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ile→Thr），第343位纈氨酸突變?yōu)楸彼幔╒al→Ala）。由密碼子第1、2位堿基同時發(fā)生突變引起的氨基酸變異位點(diǎn)有1個，發(fā)生在第322位上，密碼子由ATC變?yōu)镚CC，引起異亮氨酸突變?yōu)楸彼幔↖le→Ala）。密碼子第3位點(diǎn)上的突變未引起氨基酸變異，屬同義突變。

在斑鳠Cyt b基因編碼的氨基酸序列中，基于單倍型BHap2編碼的氨基酸序列僅檢出了6個氨基酸變異位點(diǎn)。其中，由密碼子第1位點(diǎn)堿基突變引起的氨基酸變異位點(diǎn)有3個，分別是：第364位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Gly→Ser），第366位和第371位均為亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸（Leu→Val）。由密碼子第2位點(diǎn)堿基突變引起的氨基酸變異位點(diǎn)有2個，為第17位丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔ˋla→Gly）和第64位半胱氨酸突變?yōu)槔野彼幔–ys→Tyr）。由密碼子第3位點(diǎn)堿基突變引起的氨基酸變異僅1個，即第356位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔≒he→Leu）。

2. 3 都柳江鲇、斑鳠種群的遺傳多樣性

由表4可看出，都柳江鲇種群的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均高于斑鳠種群，表現(xiàn)出相對較豐富的遺傳多樣性。鲇種群11個單倍型間的遺傳距離為0.0009～ 0.0322，平均遺傳距離為0.0163。斑鳠10個單倍型間的遺傳距離為0.0009～0.0081，平均遺傳距離為0.0030。可見，斑鳠種群個體間的遺傳分化程度較鲇種群低。

根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，都柳江鲇11個單倍型可分為兩大分支（Gp1和Gp2）。其中，Gp2包括8個單倍型，代表34個個體，為優(yōu)勢分支，包含由NHap1、NHap3、NHap4聚成的小分支和由NHap2、NHap6、NHap9、NHap10、NHap11聚成的小分支；Gp1由3個單倍型組成，代表5個個體（圖1）。斑鳠的10個單倍型也分為兩大分支，其中一個分支由9個單倍型（BHap1～BHap8和BHap10）組成，代表38個個體，為優(yōu)勢分支；另一分支僅有1個單倍型（BHap9），代表1個個體（圖2）。

2. 4 都柳江鲇、斑鳠種群的Tajimas D中性檢驗(yàn)結(jié)果

Tajimas D中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，都柳江鲇種群Tajimas D為-0.25965，未達(dá)顯著水平（P>0.05）；都柳江斑鳠種群Tajimas D為-2.18396，達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

3 討論

Avise（2000）認(rèn)為4種核苷酸在基因組中分布不均一是動物線粒體基因組的共性。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因的1122 bp序列堿基組成相似，即4種堿基平均含量均存在差異，且A+T的平均含量高于G+C的平均含量，以G含量最低，符合鲇形目魚類Cyt b基因堿基組成的特點(diǎn)（彭作剛等，2005；徐丹丹，2013）。Cyt b基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼基因，其基因序列可通過密碼子轉(zhuǎn)譯為蛋白質(zhì)氨基酸序列。本研究發(fā)現(xiàn)，在都柳江鲇、斑鳠Cyt b基因中，4種堿基在密碼子第1、2位點(diǎn)上的出現(xiàn)頻率相似，但在密碼子第3位點(diǎn)上，除了均存在反G偏倚外，鲇Cyt b基因存在明顯的A（38.5%）和C（38.2%）偏倚，斑鳠Cyt b基因則表現(xiàn)出更明顯的A偏倚（42.8%）。與之相似，竹莢魚Cyt b基因密碼子第3位點(diǎn)存在明顯的C偏倚和反G偏倚（牛素芳等，2011），滁州鯽Cyt b基因密碼子第3位點(diǎn)存在明顯的T偏倚和反G偏倚（胡玉婷等，2015）。但關(guān)于Cyt b基因密碼子第3位點(diǎn)上堿基出現(xiàn)頻率的種間差異究竟是源于功能需要還是自然選擇壓力尚無定論。

編碼蛋白質(zhì)的基因常因蛋白質(zhì)功能的需要和氨基酸三聯(lián)密碼子結(jié)構(gòu)的限制，插入/缺失很少發(fā)生或發(fā)生后很容易被自然選擇所淘汰（單云晶等，2013）。本研究結(jié)果表明，都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因均未發(fā)現(xiàn)插入或缺失，其變異表現(xiàn)為堿基替換，且多發(fā)生在密碼子第3位點(diǎn)上，密碼子第1、2位點(diǎn)變異較少；但Cyt b基因核苷酸序列結(jié)合其編碼氨基酸序列分析結(jié)果顯示，都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因編碼氨基酸的變異主要源于其密碼子第1、2位點(diǎn)上的堿基變異，而密碼子第3位點(diǎn)上的堿基替換僅導(dǎo)致氨基酸序列中的1個位點(diǎn)氨基酸發(fā)生變異。說明都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因密碼子第1、2位點(diǎn)變異率雖然較低，但其變異常導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸變異；密碼子第3位點(diǎn)由于受自然選擇的壓力較小，其變異率較高，但多為同義突變，與張艷云等（2011）對閉殼龜類的研究結(jié)果一致。

衡量物種種群遺傳多樣性的兩個重要指標(biāo)是單倍型多樣性和核苷酸多樣性，其中核苷酸多樣性比單倍型多樣性更可靠，主要是因?yàn)榍罢呖紤]了各種mtDNA單倍型在種群中的比例（李玉芳等，2014）。本研究中，都柳江鲇種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)均高于斑鳠種群，說明都柳江鲇種群的遺傳多樣性較斑鳠種群更豐富。Grant和Bowen（1998）根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性，將魚類種群分為4種類型：（1）較低的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性，表明種群近期發(fā)生了瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)系群發(fā)生了奠基者效應(yīng)；（2）較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，顯示種群經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后發(fā)生了快速擴(kuò)張，但累積的核苷酸突變尚少；（3）較低的單倍型多樣性和較高的核苷酸多樣性，意味著種群來源于兩個獨(dú)立的地理群體發(fā)生第二次接觸或由一個之前大而穩(wěn)定的種群發(fā)生了嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)所致；（4）較高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，說明種群可能由一個大而穩(wěn)定的種群經(jīng)歷較長的歷史演化或由兩個不同系群發(fā)生二次接觸所致。本研究中，都柳江鲇種群具有較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，屬于第4種類型，推測該種群由一個大而穩(wěn)定的種群演化所產(chǎn)生； 都柳江斑鳠種群具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，符合第二種類型，表明該種群可能在經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后發(fā)生了快速擴(kuò)張，其單倍型多樣性快速增加但累積的核苷酸多樣性仍較低（Avise，2000）。

Tajimas D中性檢驗(yàn)常用于推測種群曾經(jīng)過的歷史事件，當(dāng)Tajimas D為負(fù)值且統(tǒng)計學(xué)上達(dá)顯著性水平時，表明該種群在過去經(jīng)歷了擴(kuò)張事件，反之則群體大小趨于穩(wěn)定（Meyer and Wilson，1990）。本研究中，都柳江鲇種群Tajimas D為-0.25965，但未達(dá)顯著水平（P>0.05），表明該種群大小趨于穩(wěn)定；都柳江斑鳠種群Tajimas D為-2.18396且達(dá)極顯著水平（P<0.01），即都柳江斑鳠種群可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。

4 結(jié)論

都柳江鲇種群大小穩(wěn)定，具有較豐富的遺傳多樣性；都柳江斑鳠種群遺傳多樣性較匱乏，可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和種群擴(kuò)張事件，急需開展種群保護(hù)和恢復(fù)工作。

致謝：感謝貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室曾智勇教授對本研究中分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）