HPLC法測定益智健腦膠囊的含量

馬勝 唐新

【摘 要】目的：建立高效液相色譜法測定益智健腦膠囊中補骨脂素的含量。方法：采用AgiLent1 200serier SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈-水（40∶60）為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為室溫，進樣量為10 μL，檢測波長為250 nm。結(jié)果：補骨脂素在25.06～250.60 μmg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 94，平均回收率為98.97%，RSD=0.61%，補骨脂素與供試品中其他組分色譜峰達到基線分離，分離度良好，補骨脂素峰理論塔板數(shù)不低于4 000。該法簡便、快速、專屬性好，結(jié)果準確、可靠。

【關(guān)鍵詞】補骨脂素；益智健腦膠囊；高效液相色譜法；含量

【中圖分類號】R286 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2016）10-0071-04

益智健腦膠囊為廣西強壽藥業(yè)集團有限責任公司在研新藥品種，由五指毛桃、扶芳藤、牛大力、千斤拔、紅參、熟地黃、肉蓯蓉、山茱萸、當歸、肉桂、三七、升麻、甘草等13味中藥組成，具有補腎益脾、健腦生髓的功效，用于脾腎不足、精血虧虛所致健忘頭昏、步態(tài)不穩(wěn)、倦態(tài)食少、腰膝酸軟等癥。臨床上用于主治腦萎縮（癡呆癥）、中風后遺癥等疾病。處方中的君藥為五指毛桃。五指毛桃又名南芪、五爪龍、五指牛奶、土北芪，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡(luò)之功效[1]，臨床上主要用于脾虛浮腫、食少無力、肝炎、風濕痹痛、肺癆咳嗽等癥。研究表明，五指毛桃含有補骨脂素、十六酸、佛手內(nèi)酯、油酸等化合物[2-3]，其中補骨脂素為其主要成分，可作為本品含量測定基準物進行研究，以保證新藥益智健腦膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量。

腦萎縮癥是老年人的常見病和多發(fā)病，常發(fā)生于50歲以上，病程可達數(shù)年至數(shù)十年，男性多于女性，腦萎縮有彌漫性腦萎縮（包括皮層萎縮、小腦萎縮及皮層、小腦、腦干萎縮）及局限性腦萎縮（多見于局限性腦器質(zhì)性病變后如外傷、血管病、顱內(nèi)局限性感染后等），其中彌漫性腦萎縮以癡呆、智能減退、記憶障礙、性格改變、行為障礙為主。有的伴有偏癱和癲癇發(fā)作。局灶性腦萎縮以性格改變?yōu)橹?；小腦萎縮以語言障礙及形體的共濟失調(diào)和震顫為主。

腦萎縮的原因是很多方面的。由于年老血液成分異常等因素，血液的黏稠度增高，使血流緩慢、血流量減少，致使正常的機能活動所需的能量減少；且年老微循環(huán)發(fā)生障礙，微循環(huán)網(wǎng)血液不暢，則記憶商可降低；老年人動脈含氧量降低，使腦細胞陷于相對缺氧，可引起腦細胞合成各種酶和神經(jīng)傳導(dǎo)質(zhì)的量減少，均可導(dǎo)致腦萎縮。此外，遺傳在本病的發(fā)生過程中也起了一定作用，衰老的過程、代謝障礙、內(nèi)分泌機能減退等因素也與發(fā)病相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認為，腦萎縮癥屬于先天稟賦不足，腎元虧虛或疾病遷延日久，氣血不足，腦髓不充，筋脈失養(yǎng)所致；或因情志失調(diào)、氣機不暢、氣滯血瘀致使五臟功能失調(diào)使然，其中以腎元虧虛為本。腎受五臟六腑之精而藏之，且生髓并上注于腦，使髓海充養(yǎng)，髓海有余，則輕勁多力，自過其度。此外，本病與肝、脾二臟功能失調(diào)，亦有著十分密切的關(guān)系。因此，補腎健脾是治療本病的根本，益智健腦膠囊由五指毛桃等13味中藥組成，具有補腎益脾、健腦生髓的功效，對治療腎虛、脾虛引起的腦萎縮癥具有較好的療效。腦萎縮癥病因復(fù)雜，起病緩慢，不易被發(fā)覺，病程長，進展緩慢，而且可能逐漸加重，影響患者的正常生活和工作，及早發(fā)現(xiàn)、積極適當?shù)乜刂撇∏楹瓦M一步治療具有重要意義。

1 儀器與試藥

美國AngiLent公司1 200高效液相色譜儀；AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。

補骨脂素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110739-201508），乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。益智健腦膠囊及缺五指毛桃的陰性對照樣品為廣西強壽藥業(yè)集團有限責任公司自制樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgiLent C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈-水（40∶60）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為250 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL·min-1。

在上述色譜條件下，補骨脂素與供試品中其他組分色譜峰達到基線分離，分離度良好，補骨脂素峰理論塔板數(shù)不低于4 000，補骨脂素及益智健腦膠囊供試樣品色譜圖如圖1所示。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的補骨脂素對照品適量，用甲醇制成每1 mL含50 μg的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，傾出內(nèi)容物，研細，取約2.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）60 min，取出放冷，過濾，濾渣及濾器用甲醇適量洗滌3次，濾液及洗滌液置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取干燥至恒重的補骨脂素對照品12.53 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1、2、4、6、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，與儲備液一起組成6個不同濃度的對照品溶液。精密吸取以上不同濃度對照品溶液各10 μL進樣分析，以對照品溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，則補骨脂素的回歸方程為y=1 860 509.68x+121 204.36（r=0.999 94）。結(jié)果表明，補骨脂素在25.06～250.60 μmg/mL濃度范圍內(nèi)時，進樣量10 μL與補骨脂素峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密量取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，結(jié)果補骨脂素峰面積RSD為1.02%，表明精密度較好（見表1）。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取益智健腦膠囊同一供試品溶液（批號：150601）在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣10 μL測定，結(jié)果供試品溶液補骨脂素峰面積RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，峰面積沒有在考察時間內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢（見表2）。

2.7 重復(fù)性實驗

精密稱取同一批益智健腦膠囊（批號：150601）細粉6份，按“供試品溶液的制備”項下方法制成供試品溶液，并在上述色譜條件下進樣10 μL，測定補骨脂素峰面積，計算含量。結(jié)果供試品中補骨脂素含量的RSD值為1.02%，表明實驗方法的重復(fù)性較好（見表3）。

2.8 回收率實驗

分別精密稱取9份已知含量的益智健腦膠囊（批號：150601）細粉約1.0 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中。精密稱取補骨脂素對照品15.46 mg置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。每個具塞錐形瓶分別準確加入對照品5 mL和甲醇45 mL，按“供試品溶液的制備”項下方法制成供試品液，在上述色譜條件下進樣10 μL測定，結(jié)果平均回收率為98.97%，RSD=0.61%（見表4）。

2.9 干擾試驗

取缺五指毛桃的陰性樣品，按“供試品溶液的制備”項下的方法制成陰性樣品溶液，在上述色譜條件下進樣10 μL測定。試驗結(jié)果表明，本品輔料在補骨脂素出峰時間無吸收，證明輔料對補骨脂素的測定無干擾，從而可保證本品測定方法的準確性。

2.10 樣品測定

精密吸取供試品溶液10 μL分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，每樣平行測定5份，計算樣品中補骨脂素的含量，結(jié)果10批樣品的補骨脂素含量為1.483 1～1.534 6 mg/g（見表5）。

3 討論

（1）供試品溶液制備的選擇采用甲醇直接超聲提取并稀釋樣品后進樣，樣品色譜峰中，在補骨脂素出峰時間的2倍以后未出現(xiàn)雜質(zhì)峰，方法簡便，分離效果理想。

（2）波長的選擇。取補骨脂素對照品溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在波長250 nm處有最大吸收，故檢測波長確定為250 nm。

（3）流動相選擇。根據(jù)文獻資料及自擬，選擇了4個不同組成的流動相進行篩選試驗，結(jié)果流動相[乙腈-水（40∶60）]峰形良好，被測成分分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000。

（4）柱溫、流速改變的影響。取對照品溶液進樣，考察初始柱溫在20℃、25℃、30℃，流速在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min條件下，被測成分的分離度，結(jié)果柱溫在25℃、流速為1.0 mL/min時分離度良好，能夠保證補骨脂素檢測的準確性。

（5）不同牌子或型號柱子的影響。采用3個不同廠家（“菲羅門”“安捷倫”“伊力特”）不同型號的柱子按相同色譜條件進樣，結(jié)果被測成分分離度均良好，證明不同牌子或型號的柱子對本品檢測影響不大。

（6）流動相比例的影響。對本品檢測流動相[乙腈-水（40∶60）]的比例進行微調(diào)，進樣檢測，結(jié)果被測成分分離度均良好，證明本品檢測使用的流動相較為適宜。

（7）破壞性試驗的影響。采用強酸、強堿、高熱、高濕、強光、氧化等方法對本品供試品液進行人為破壞，并進樣檢測，結(jié)果被測成分峰形良好，保留時間、分離度、板數(shù)均符合要求，證明本品檢測方法準屬性較強。

（8）重現(xiàn)性試驗。在不同實驗室，由不同分析人員分別對同一批樣品進行檢測，結(jié)果RSD值為1.02%，誤差在規(guī)定范圍內(nèi)，證明本檢測方法重現(xiàn)性良好。

4 小結(jié)

本文建立的高效液相色譜法，結(jié)果較為準確，且簡便、快速、專屬性強、可靠。

參 考 文 獻

[1]現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典編委會.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：371.

[2]董青松，歐彪，陳乾平，等.五指毛桃研究進展[J].廣西醫(yī)藥，2006，28（6）：950-952.

[3]趙麗萍，狄文武，馮鋒，等.五指毛桃的化學(xué)成分[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（1）：5-7.

[責任編輯：陳澤琦]