辣椒CaDREB3基因的克隆和表達(dá)特性分析

馮冬林　何水林　賴燕

摘 要 從構(gòu)建的辣椒cDNA文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序并獲得辣椒CaDREB3基因，研究該基因的亞細(xì)胞定位、瞬時(shí)表達(dá)及組織表達(dá)特性，揭示CaDREB3的功能及其在植物抗逆過(guò)程中的分子機(jī)制。應(yīng)用預(yù)測(cè)軟件對(duì)其進(jìn)行功能及生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR分析CaDREB3基因的瞬時(shí)表達(dá)及在不同組織中的表達(dá)特性，并以基因槍轟擊洋蔥表皮的方法，對(duì)CaDREB3基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明，辣椒CaDREB3長(zhǎng)度為1 997 bp，含有1071bp的完整的開(kāi)放閱讀框，編碼357個(gè)氨基酸，含有ERF亞族的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，與西紅柿（NP_001234707.1）、馬鈴薯（AET99101.1）及擬南芥（NP_177931.1）具有較高的氨基酸相似性，其中與西紅柿的相似性最高，達(dá)83%。亞細(xì)胞定位表明該基因位于細(xì)胞核，瞬時(shí)表達(dá)表明CaDREB3可以和GCC-box結(jié)合，qRT-PCR檢測(cè)表明， CaDREB3基因的相對(duì)表達(dá)量在辣椒莖、葉和果實(shí)中表達(dá)量較高。實(shí)驗(yàn)明確了辣椒CaDREB3基因亞細(xì)胞定位信息和組織表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究其功能及分子機(jī)制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 辣椒；CaDREB3；亞細(xì)胞定位；瞬時(shí)表達(dá)；熒光定量RT-PCR

中圖分類號(hào) Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

在植物中廣泛存在ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族成員，ERFs家族成員包含有1個(gè)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含約60～70個(gè)氨基，根據(jù)該結(jié)構(gòu)域第14位和19位氨基酸殘基的不同，可以將ERFs家族分為ERF亞家族和DREB亞家族。DREB亞家族成員的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域在第14位和19位分別為纈氨酸和谷氨酸，區(qū)別于ERF的丙氨酸和天冬氨酸。同時(shí)DREB轉(zhuǎn)錄因子序列中含有一段Ser/Thr區(qū)域，研究表明該序列在基因互作中起到重要作用[1]。

Sakuma[2]根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子因結(jié)構(gòu)及功能上的不同，將DREBs亞族轉(zhuǎn)錄因子分為A1～A6六個(gè)亞組。迄今為止在植物中發(fā)現(xiàn)并深入研究的主要是DREB1（A1）和DREB2（A2）兩大類[3]。該兩類轉(zhuǎn)錄因子都能夠識(shí)別DRE（含有A/GCCGAC）順式作用元件，在植物抵抗非生物脅迫如低溫、干旱和高鹽過(guò)程中具有重要的作用[4]。Hong等[5]在辣椒中克隆的CaDREBLP1能夠在干旱及鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)；Chen等[6]研究表明，轉(zhuǎn)基因GmDREB2大豆能夠增強(qiáng)作物抗旱及抗鹽能力；Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因PpDREB1煙草能夠增強(qiáng)抗鹽、抗旱及抗低溫的能力。Wang等[8]的研究結(jié)果表明檸條CkDREB基因不僅在干旱、高鹽及低溫下誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)能夠在ABA處理下誘導(dǎo)表達(dá)。而DREB2類轉(zhuǎn)錄因子在生物功能上表現(xiàn)出了比DREB1類轉(zhuǎn)錄因子更多樣化，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的DREB2A、DEB2B基因不僅在干旱、高鹽及低溫下誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)能夠在熱激脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)[9-11]。

除了DREB1和DREB2類轉(zhuǎn)錄因子，研究表明其他DREB亞組基因在應(yīng)答逆境脅迫和提高植物抗性上起到一定的作用。A3亞組ABI4基因在ABA和糖信號(hào)途徑中具有特殊的作用[12-13]；A4亞組基因同DEEB1類基因相關(guān)，過(guò)量表達(dá)TINY和HARDY[14-15]導(dǎo)致植株生長(zhǎng)矮化且葉片濃密；A5亞組基因含有一個(gè)保守的EAR（ERF-associated amphiphilic repression）基序[16-17]，轉(zhuǎn)基因DREB1A或DREB2A CA誘導(dǎo)其上調(diào)表達(dá)[18-19]；A6亞組RAP2.4和RAP2.4B基因能夠在干旱、高溫及高鹽下誘導(dǎo)表達(dá)，RAP2.4和RAP2.4B還分別應(yīng)答低溫和熱激脅迫[20-21]。

辣椒（Capsicum annuum L.）作為一種世界上重要的蔬菜種類和工業(yè)加工原料，在其整個(gè)生育時(shí)期隨時(shí)都會(huì)受到外界環(huán)境脅迫?，F(xiàn)階段生態(tài)環(huán)境破壞，常規(guī)防治手段效果不明顯反而有時(shí)會(huì)進(jìn)一步造成環(huán)境惡化，進(jìn)入惡性循環(huán)。在此背景條件下，了解作物抗逆機(jī)制，以生物技術(shù)及基因工程技術(shù)入手，結(jié)合常規(guī)育種手段，以期選育獲得抗逆性強(qiáng)的品種及控制品種優(yōu)良性狀的目的。本研究從辣椒cDNA文庫(kù)中篩選獲得了一個(gè)全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，暫時(shí)命名為CaDREB3。采用基因槍法明確CaDREB3的亞細(xì)胞定位信息，及其與順式作用元件瞬間表達(dá)分析，利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在辣椒不同組織中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步深入研究CaDREB3基因的功能提供參考，為研究辣椒DREB轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的抗逆機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用福建本地辣椒品種8#材料，構(gòu)建辣椒葉片cDNA文庫(kù)，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2 方法

基因克隆與序列分析：隨機(jī)挑取cDNA文庫(kù)陽(yáng)性克隆，以M13R為測(cè)序引物，測(cè)序。利用NCBI和DNAMAN軟件，分析基因序列和其開(kāi)放閱讀框，進(jìn)行Blastn序列比對(duì)。利用Prosite 數(shù)據(jù)庫(kù)、SMART和WOLF PSORT分別查找功能結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)、分析蛋白結(jié)構(gòu)與功能并預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用ClustalX分析分子進(jìn)化，利用Mega4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

載體構(gòu)建：采用Gateway技術(shù)。以pDONR207作為入門載體，構(gòu)建亞細(xì)胞定位目的載體pMDC83、瞬間表達(dá)分析報(bào)告載體pBT10-GUS-GCC和pBT10-GUS-CRT/DRE。載體構(gòu)建引物如表1。

采用基因槍轟擊洋蔥表皮法進(jìn)行瞬間表達(dá)分析[22]；在熒光顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位并采集圖像；利用RT-PCR分析辣椒根、莖、葉、花及果實(shí)等組織特異性表達(dá)[23]，以actin基因作為內(nèi)參基因（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaDREB3基因全長(zhǎng)cDNA的分離

陽(yáng)性克隆測(cè)序后將EST片段進(jìn)行分子比對(duì)表明：基因全長(zhǎng)為1 997 bp，分子量39.214 ku，含有1 071 bp的完整的開(kāi)放閱讀框，編碼357個(gè)氨基酸（圖1）；Blastp顯示該基因與西紅柿SlDREB3（NP_001234707.1）氨基酸序列相似度最高為83%，與馬鈴薯StDREB4（AET99101.1）及擬南芥RAP2.4（NP_177931.1）氨基酸序列相似度均達(dá)到47%以上，因此，初步將該基因命名為CaDREB3（圖1）。

2.2 辣椒CaDREB3基因保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，在AP2/ERF結(jié)構(gòu)域第14位和19位為區(qū)別于ERF亞族特有的纈氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb亞族特有，同時(shí)在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2（圖2）。利用MEGA4.0將辣椒CaDREB3與西紅柿及馬鈴薯等37個(gè)氨基酸相似序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，辣椒CaDREB3與西紅柿及馬鈴薯相關(guān)DREB基因同源性最高，在76%以上，同屬于ERF家族Ⅰb（A6）亞族。

2.3 CaDREB3基因組織特異性表達(dá)分析

組織表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，在辣椒莖、葉片和果實(shí)中CaDREB3均有表達(dá)，在根和花中沒(méi)有表達(dá)。在莖中的表達(dá)量最高，而葉片中的表達(dá)量次之（圖4）。

2.4 CaDREB3與GCC-box、CRT/DRE順式元件結(jié)合能力分析

基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，以空載體為陰性對(duì)照，分析基因瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果表明該基因能夠與GCC-box盒發(fā)生互作，與DRE順式元件不能互作（圖5）。

2.5 CaDREB3亞細(xì)胞定位分析

首先利用WOLF PSORT預(yù)測(cè)CaDREB3的亞細(xì)胞定位信息，結(jié)果表明，CaDREB3有可能位于細(xì)胞核上。CaDREB3-GFP融合蛋白和空載體通過(guò)基因槍轟擊洋蔥表皮，在熒光顯微鏡下觀察CaDREB3融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空載體分布于整個(gè)細(xì)胞中，而CaDREB3融合蛋白位于細(xì)胞核上（圖6）。

3 討論

DREB和ERF是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族中重要的兩個(gè)亞族，在抵抗環(huán)境和生物、非生物脅迫方面都具有重要的作用。已有研究表明，DREB在抵抗低溫、高鹽及干旱等非生物脅迫方面具有重要的作用[4]，并且能夠應(yīng)答ABA激素信號(hào)。

本研究從辣椒cDNA文庫(kù)中挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序并獲得了辣椒CaDREB3基因編碼區(qū)序列。分析CaDREB3基因保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在第14位和第19位是DREB亞族特有的纈氨酸和亮氨酸。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb（A6）亞組特有，研究發(fā)現(xiàn)該亞族基因玉米DBF1能夠激活干旱應(yīng)答因子2（DRE2），提高植物抗旱能力[24]。同時(shí)在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2，過(guò)量表達(dá)蒺藜苜蓿MtWXP1可以提高蠟的含量，而WXP1蛋白含有Ⅰb亞族中所有的保守序列[25]。根據(jù)Ⅰb（A6）亞組多種植物在抗非生物脅迫上表現(xiàn)，推測(cè)CaDREB3可能存在相類似的功能。

大量研究表明DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合DRE順式元件，從而激活目的基因的表達(dá)。而且不同的DREB蛋白可以結(jié)合不同的DRE核心序列（ACCGAC和GCCGAC），表明DREB轉(zhuǎn)錄因子作用機(jī)制的復(fù)雜性。而本實(shí)驗(yàn)瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示CaDREB3可以和GCC-box順式元件相結(jié)合，而不能與DRE元件結(jié)合，表明CaDREB3可能應(yīng)答生物脅迫，以調(diào)節(jié)病程相關(guān)（PR）基因的表達(dá)。CaDREB3不能夠與CRT/DRE順式元件相結(jié)合，或許CaDREB3不能夠應(yīng)答非生物脅迫，或在生物及非生物脅迫間具有某種交叉信號(hào)途經(jīng)。DREB家族Ⅰb（A6）亞族基因數(shù)量不多且功能研究較少，CaDREB3作為其中一員，其功能研究的進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)于該亞族基因在植物中的相關(guān)作用具有重要意義。同時(shí)序列分析表明CaDREB3不含有EAR元件，暗示了該基因在植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的某種激活機(jī)制。

通過(guò)WOLF PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果表明CaDREB3 可能定位于細(xì)胞核上，而亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果表明，CaDREB3定位于細(xì)胞核上。因此可以初步判定CaDREB3定位于細(xì)胞核上。

綜上所述，CaDREB3作為Ⅰb（A6）亞族一員，由于迄今為止對(duì)該亞族基因的功能還不太清楚，同時(shí)CaDREB3表現(xiàn)出能夠特異結(jié)合GCC-box盒，而不是DRE序列，說(shuō)明該基因功能及其作用機(jī)制都具有一定的不確定性，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)對(duì)其考證并探索DREB的作用原理。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了辣椒CaDREB3基因，全長(zhǎng)1 997 bp，其含有1 071 bp的完整的開(kāi)放閱讀框，編碼357個(gè)氨基酸，在AP2/ERF結(jié)構(gòu)域第14位和19位為DREB亞族特有的纈氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb亞族特有，同時(shí)在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CaDREB3基因在莖中表達(dá)量大幅升高，在葉和果實(shí)的表達(dá)量也有上升。CaDREB3蛋白主要定位于細(xì)胞核中，能夠與GCC-box盒相結(jié)合，不能同DRE元件結(jié)合。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CaDREB3蛋白的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為研究DREB類轉(zhuǎn)錄因子的功能提供了新的候選基因。

參考文獻(xiàn)

[1] Yamaguchi-Shinozaki K， Kazuo Shinozaki. A novel cis-acting element in an arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought， low-temperature， or high-salt stress[J]. Plantcell， 1994， 6： 251-264.

[2] Sakuma Y， Liu Q， Dubouzet J G， et al. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs， transcription factors involved in dehydration and cold-inducible gene expression[J]. Biochem Biophys Res Com-mun， 2002， 290： 998-1 009.

[3] Dubouzet J G， Sakuma Y， Ito Y， et al. OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought， high-salt and cold-responsive gene expression[J]. Plant J， 2003， 33： 751-763.

[4] Shinozaki K， Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature： differences and cross-talk between two stress signaling pathways[J]. Curr Opin Plant Biol， 2000（3）： 217-223.

[5] Hong J P， Kim W T. Isolation and functional characterization of the Ca-DREBLP1 gene encoding a dehydration-responsive element binding-factor-like protein 1 in hot pepper（Capsicum annuum L. cv Pukang）[J]. Planta， 2005， 220： 875-888.

[6] Chen M， Wang Q Y， Cheng X G， et al. GmDREB2， a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 353： 299-305.

[7] Liu N， Zhong N Q， Wang G L. Cloning and functional characteri-zation of PpDBF1 gene encoding a DRE-binding transcription factor from Physcomitrella patens[J]. Planta， 2007， 226： 827-838.

[8] Wang X， Chen X， Liu Y， et al. CkDREB gene in Caragana korshinskii is involved in the regulation of stress response to multiple abiotic stresses as an AP2/EREBP transcrip-tion factor[J]. Mol Biol Rep， 2011， 38： 2 801-2 811.

[9] Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors， DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression， respectively， in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 1998， 10： 1 391-1 406.

[10] Nakashima K， Shinwari Z K， Sakuma Y， et al. Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration-and high-salinity-responsive gene expression[J]. Plant Mol Biol， 2000， 42： 657-665.

[11] Sakuma Y， Maruyama K， Qin F， et al. Function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103： 18 822-18 827.

[12] Koussevitzky S， Nott A， Mockler T C， et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression[J]. Science， 2007， 316： 715-719.

[13] Niu X， Helentjaris T， Bate N J. Maize ABI4 binds coupling element1 in abscisic acid and sugar response genes[J]. Plant Cell， 2002， 14： 2 565-2 575.

[14] Karaba A， Dixit S， Greco R， et al. Improvement of water use efficiency in rice by expression of HARDY， an Arabidopsis drought and salt tolerance gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104： 15 270-15 275.

[15] Wilson K， Long D， Swinburne J， et al. A dissociation insertion causes asemidominant mutation that increases expression of TINY， an Arabidopsis gene related to APETALA2[J]. Plant Cell， 1996， 8： 659-671.

[16] Huang B， Liu J Y. A cotton dehydration responsive element binding protein functions as a transcriptional repressor of DRE-mediated gene expression[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 343： 1 023-1 031.

[17] Chen M， Wang Q Y， Cheng X G， et al. GmDREB2 a soybean DRE-binding transcription factor， conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 353： 299-305.

[18] Maruyama K， Sakuma Y， Kasuga M， et al. Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems[J]. Plant J， 2004， 38： 982-993.

[19] Lim C J， Hwang E J， Chen H， et al. Over-expression of the Arabidopsis DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermo tolerance[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 362： 431-436.

[20] Lin R C， Park H J， Wang H Y. Role of Arabidopsis RAP2.4 in regulating light-and ethylene-mediated developmental processes and drought stress tolerance[J]. Mol Plant， 2008（1）： 42-57.

[21] Rae L， Lao N， Kavanagh T. Regulation ofmultiple aquaporin genes in Arabidopsis by a pair of recently duplicated DREB transcription factors[J]. Planta doi： 2011，10.1007/s00425-011-1414-z.

[22] 李超穎. CaSC1基因啟動(dòng)子的分離及其缺失體在煙草中的瞬間表達(dá)分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[23] 林 菁. 辣椒轉(zhuǎn)錄因子CaNAC72的克隆及其功能鑒定[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[24] Espartero J， Pintor-Toro J A， Pardo J M. Differential accumulation of S-adenosylmethionine synthetase transcripts in response to salt stress[J]. Plant Mol Biol， 1994， 25： 217-227.

[25] Slaymaker D H， Navarre D A， Clark D， et al. The tobacco salicylic acid-binding protein 3（SABP3）is the chloroplast carbonic anhydrase， which exhibits antioxidant activity and plays a role in the hypersensitive defense response[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 11 640-11 645.