菠蘿AcHMGR基因的克隆與表達分析

李運合　孫光明　吳青松

摘 要 以菠蘿（Ananas comosus L. cv. Comte de Paris）果實為材料，采用RT-PCR結合RACE方法得到3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因（命名為AcHMGR）的cDNA及基因組DNA全長。AcHMGR的cDNA全長2 407 bp，其開放讀碼框長度為1 740 bp，編碼579個氨基酸；其基因組DNA全長為4 115 bp，從起始密碼子到終止密碼子的長度為3 764 bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。熒光定量PCR結果表明，對照的菠蘿果實中，AcHMGR基因表達量在花后0 d最高，從花后30 d開始，其表達量急劇下降，之后維持在一個較低水平直到果實成熟。經(jīng)20 mg/L N-（2-氯-4-吡啶基）-N'-苯基脲（CPPU）處理后，顯著提高了AcHMGR基因在花后30 d果實中的相對表達量，為同期對照的1.8倍；但其他時期的相對表達量與對照相比無明顯差異。研究結果表明，AcHMGR基因在菠蘿果實早期發(fā)育過程中表達量較高，CPPU處理提高了AcHMGR基因的相對表達量并顯著提高果實的重量，說明CPPU處理后AcHMGR基因可能在促進果實重量的增加中起著重要作用。

關鍵詞 菠蘿；AcHMGR基因；細胞分裂；CPPU

中圖分類號 S668.3 文獻標識碼 A

我國是世界菠蘿（Ananas comosus L.）生產(chǎn)大國，主要集中在華南地區(qū)，2012年產(chǎn)量約為100萬t，位居世界第8位[1]。但我國菠蘿平均單產(chǎn)與國外相比有很大差距，2012年平均單產(chǎn)居世界第27位，只有18 869 kg/hm2，低于世界平均水平，尚不及世界最高單產(chǎn)國家（124 534 kg/hm2）的1/6[1]。菠蘿果實為頭狀花序自莖頂端葉叢抽出，發(fā)育而成的聚合果；每個植株上只有1個果實，因此在密度達到一定程度后，菠蘿單果重（大?。Q定了最終產(chǎn)量。果實的大小是許多作物如菠蘿的一個重要經(jīng)濟指標，其受內(nèi)部發(fā)育信號和環(huán)境因素影響[2-4]。菠蘿果實大小受多種因素調(diào)控，與種植密度、催花時植株大小、水肥管理等多種因素均密切相關[5]，最終果實細胞數(shù)目、細胞體積和小果（果眼）數(shù)目共同決定了果實的最終大小[6]。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HMGR）催化HMG-CoA產(chǎn)生甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA），這是類異戊二烯（isoprenoid）生物合成途徑中的關鍵一步[7-9]；這步反應是不可逆的，因此認為HMGR是MVA途徑中的一個限速關鍵酶[10]。類異戊二烯參與了植物的多個生物進程，包括固醇和植物生長調(diào)節(jié)劑（生長素、脫落酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯）的合成等[11-12]。

前人研究表明，番茄（Solanum lycopersicum）[13]、鱷梨（Persea americana Mill. cv Hass）[11]、荔枝（Litchi chinensis）[14]果實的早期發(fā)育都有3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）的參與；甜瓜（Cucumis melo L.）HMGR基因（CmHMGR基因）的相對表達量和酶活性在授粉后的果實發(fā)育早期均明顯提高[15]，而過量表達CmHMGR基因的轉基因甜瓜株系，其果實重量相比對照增加了20%[16-17]。這些研究都表明HMGR基因在決定果實大小中起著重要的作用。另一方面，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上合理使用植物生長調(diào)節(jié)劑提高作物產(chǎn)量與品質已有大量報道。N-（2-氯-4-吡啶基）-N′-苯基脲[N-（2-chloro-4-pyridyl）-N′-phenylurea， CPPU]是一種人工合成的苯基脲類細胞分裂素，具有促進細胞分裂和增大等多種功能[18-19]。已有的研究表明，在獼猴桃（Actinidia deliciosa C.F. Liang et A.R. Ferguson cv. Qinmei）[20]、甜柿（Diospyros kaki Linn）[21]、日本柿 （Diospyros kaki Thunb.）[22]等多種果樹的花期或幼果期外施CPPU，均能起到提高果實重量或改善果實品質的效果；而對菠蘿外施一定濃度的CPPU，也能顯著提高其果實重量[23]。本試驗以菠蘿果實為材料，克隆分離了菠蘿AcHMGR基因，并對其施用CPPU后的表達模式變化進行了研究，以期為研究菠蘿果實大小的調(diào)控機制打下一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及CPPU處理

試驗于2013年8～11月在廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所進行，菠蘿品種為皇后類的巴厘種（‘Comte de Paris）。CPPU為BBI公司產(chǎn)品，純度>98%；參考李運合等[23]的試驗結果，在本試驗中的CPPU的使用濃度為20 mg/L。

在菠蘿謝花后15 d和30 d，對菠蘿果實噴施20 mg/L的CPPU，以清水為對照。處理和對照各150個果。噴施量以果實表面有溶液自然下淌為止。

在花后75 d左右，菠蘿果實成熟，此時分別測定90個對照及95個CPPU處理的果實重量。

1.2 方法

1.2.1 AcHMGR基因的克隆 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LA Taq酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.4.0、感受態(tài)細胞DH5α、dNTP mixture以及克隆載體pMD18-T vector等都購于寶生生物工程（大連）有限公司。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索HMGR基因的氨基酸序列，選擇與菠蘿親緣關系相對較近的8個序列，利用iCODEHOP v1.1程序[24]設計一對簡并引物即AcHMGRSP1和AcHMGRSP2（表1）。取開花30 d 后的菠蘿果實，按照Fu等[25]的方法提取RNA，然后以Oligo T為引物，參照說明書的方法用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit將其反轉錄成cDNA。再以此cDNA為模板，以AcHMGRSP1和AcHMGRSP2為引物進行PCR擴增。PCR反應體系及條件參考Li等[26]的實驗結果。

在獲得中間片段后，用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）進行5′ RACE和3′ RACE反應，獲得其5′和3′末端。反應條件參照試劑盒說明書，所用引物序列見表1及說明書。

用Plant DNAout kit（Tiandz， Beijing， China）提取菠蘿基因組DNA，在通過RACE方法獲得AcHMGR基因的全長后，在其5′-UTR和3′-UTR分別設計引物，分別以cDNA和基因組DNA為模板進行PCR，分別對AcHMGR基因cDNA全長進行驗證及基因組DNA全長的獲取。反應條件同Li等[26]的方法。

PCR反應結束后，將獲得的目的條帶通過電泳進行分離，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.4.0進行割膠回收純化，將其與pMD18-T Vector連接后轉化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和雙酶切，挑取陽性菌落進行培養(yǎng)，送菌液至廣州Invitrogen公司進行序列測定。獲得測序結果后通過GenBank進行BLAST搜索對比。

1.2.2 生物信息學分析 核酸序列和其推導的氨基酸序列及開放閱讀框（Open reading frame，ORF）通過NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行在線分析。通過pI/MW Tool（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）計算獲得AcHMGR的分子量及等電點。推導的氨基酸序列在NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進行分析來尋找保守域。通過ClustalW（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/）對氨基酸序列進行對比，將獲得的對比結果上傳到BOXSHADE（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進行格式整理，之后用MEGA 4.1構建HMGR蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 熒光定量PCR 利用實時熒光定量PCR技術分析AcHMGR在菠蘿果實的不同發(fā)育階段的表達變化。以菠蘿Actin基因[26]作為內(nèi)參（表1）。從開花后0 d開始，將處理和對照不同發(fā)育時期的果實提取RNA后，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa Bio Inc.， Dalian， China）對其反轉錄獲得cDNA后儲存于-20 ℃進行備用。實時熒光定量PCR試劑盒為Thermo Scientific DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit（Thermo），儀器為Roche LightCyclerR 480II熒光定量PCR儀，反應體系及條件參照試劑盒說明書。實時熒光定量PCR中所用引物見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，實時熒光定量PCR 結果用平均值±標準誤（Means±S.E.）表示，對照與處理之間顯著性差異分析通過paired-samples t test 進行。

2 結果與分析

2.1 CPPU對菠蘿果實重量的影響

在花后15 d和30 d分別對菠蘿果實噴施20 mg/L的CPPU，對果實重量影響明顯。清水對照單果平均重830.2 g，CPPU處理果實平均增重11.87%，為928.7 g。這點與前期試驗結果相類似，對花后20 d和35 d的菠蘿果實，噴施20 mg/L CPPU，果實增重9.1%[23]，說明適宜濃度的CPPU處理，能提高菠蘿果實的重量。

2.2 AcHMGR的克隆及序列分析

以花后30 d的菠蘿果實RNA反轉錄cDNA為模板，以AcHMGRSP1和AcHMGRSP2（表1）為引物，進行PCR后得到1個長度為1 259 bp的片段，通過BLAST分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物HMGR基因家族。之后利用RACE方法分別得到此片段的5′和3′末端序列，拼接這些序列后得到了其cDNA全長，全長2 407 bp。經(jīng)過BLAST及進化分析，命名為AcHMGR（GenBank登錄號分別為KM062072），其開放讀碼框長度為1 740 bp，編碼579個氨基酸，推導的AcHMGR蛋白分子量為60.8 ku，等電點為7.51。

在獲得AcHMGR基因的cDNA全長后，分別在其3′-UTR和5′-UTR設計引物，以提取到的菠蘿基因組DNA為模板進行PCR，獲得AcHMGR的基因組DNA全長，其長度為4 115 bp，從起始密碼子到終止密碼子的長度為3 764 bp（GenBank登錄號為KX375811）。比較AcHMGR mRNA與其基因組DNA全長后發(fā)現(xiàn)，從起始密碼子到終止密碼子，AcHMGR含有3個內(nèi)含子（Intron）和4個外顯子（Exon），各個外顯子長度及位置如圖1所示。

2.3 AcHMGR蛋白結構及序列分析

在NCBI對AcHMGR序列進行Blastx后發(fā)現(xiàn)，其編碼的氨基酸與多種植物的3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase（HMGR）相似度較高，其中AcHMGR與小果野蕉（Musa acuminata，

XP_009387500）、水稻（Oryza sativa Japonica Group，XP_015648250）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003572378）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii，EMT29532）、 棕櫚（Elaeis guineensis，XP_010927300）相似度較高，分別為85%、85%、83%、83%、82%。部分氨基酸序列對比結果見圖2。

將AcHMGR基因推導的氨基酸序列提交到NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）進行搜索，發(fā)現(xiàn)AcHMGR含有1個HMG-CoA_

reductase_classI（cd00643）保守域，位于第154-557個氨基酸（圖3）。

為了確定AcHMGR的系統(tǒng)進化位置，通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，選取了30個與AcHMGR蛋白同源性較高的其他植物的HMGR氨基酸序列，用MEGA4.1通過Neighbor joining（NJ）法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示AcHMGR與小果野蕉（Musa acuminata）、棕櫚（Elaeis guineensis）、砂仁（Amomum villosum）遺傳距離較近（圖4）。

2.4 菠蘿果實發(fā)育過程中AcHMGR的表達變化

對于對照的菠蘿果實，AcHMGR基因的表達量在花后0 d最高，從花后30 d開始，其表達量急劇下降，只為花后0 d的1/3左右，之后其相對表達量不再有明顯變化，直到果實成熟（圖5）。

20 mg/L的CPPU處理后，顯著提高了AcHMGR基因在花后30 d的果實中的相對表達量（p<0.05），為同期對照的1.8倍；但其他時期的相對表達量與對照相比并無明顯差異（圖5）。

3 討論

本研究從菠蘿果實中克隆得到了1個AcHMGR的cDNA及基因組DNA全長。氨基酸序列多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示AcHMGR與EgHMGRR、MaHMGR、AvHMGR有較高的同源性，且具有HMG-CoA_reductase_classI保守域，這些結果表明，AcHMGR為HMGR家族的同源基因，可能與其他HMGR具有相似的結構和功能。

熒光定量PCR結果表明，AcHMGR基因在花后0 d的相對表達量最高，之后急劇下降，這也與前人的研究相吻合[11，14-15]。荔枝LcHMGR2在花期的0 d的相對表達量還較低，但是在花期第7天其表達量急劇上升，達到頂峰，然后在花期14 d后其表達量急劇下降，之后一直維持著一個較低的表達水平，兩個LcHMGR基因都在荔枝果實早期發(fā)育期間表達量最高，而這個時期是荔枝果實的細胞快速分裂期[14]。菠蘿果實為聚合果，小花開放是自下而上，大約持續(xù)半個月左右， 從開花開始到花期結束后30 d，果實都處于一個快速的細胞數(shù)目增長期[6]，AcHMGR基因在花后0 d的表達量最高，也說明了AcHMGR基因可能與菠蘿果實細胞分裂相關。

本試驗中，20 mg/L的CPPU處理顯著提高菠蘿的果實，但AcHMGR基因只有在花后30 d的相對表達量與對照相比顯著提高，這可能與花后45 d后，菠蘿果實細胞分裂已經(jīng)進入一個平臺期有關[6]，即CPPU僅能促進AcHMGR基因在細胞快速分裂期的表達。這意味著可以將CPPU的施用時間提早到花后0 d甚至剛開始開花時，因為這個時期菠蘿果實正處于細胞快速分裂期[6]，這樣可能更有利于促進菠蘿果實細胞表達，從而有可能提高果實重量。

不同的植物生長調(diào)節(jié)劑可能通過不同的機制提高果實重量。前期試驗結果表明，50 mg/L的赤霉素（GA3）顯著提高菠蘿果實重量，通過細胞學觀察和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，其主要是通過增大細胞體積從而提高果實重量的[27]。而日本柿噴施CPPU后，延長了薄壁細胞的膨大期并促進了細胞膨大速率，因此提高了果實重量[22]。另一方面，CPPU促進獼猴桃果實發(fā)育，其原因可能就是增強了果實調(diào)運光合產(chǎn)物的能力，使細胞分裂加快和延長，并促使細胞膨大[20]。在本實驗中，CPPU處理增加了AcHMGR基因的相對表達量，同時提高了菠蘿果實重量，這說明AcHMGR基因的相對表達量可能與菠蘿果實重量相關。但CPPU是通過增大細胞大小還是提高細胞數(shù)目的方式從而提高菠蘿果實重量，尚需在后續(xù)試驗中采用組織學觀察等方法加以確認。

參考文獻

[1] FAO. http：//faostat.fao.org/site/567/default.aspx. 2012.[OL]. 2016-05-10.

[2] Mizukami Y. A matter of size： developmental control of organ size in plants[J]. Curr Opin Plant Biol， 2001， 4（6）： 533-539.

[3] Chevalier C. 12 Cell cycle control and fruit development[J]. Annual Plant Reviews， Cell Cycle Control and Plant Development， 2007， 32： 269-293.

[4] Tsukaya H. Controlling size in multicellular organs： focus on the leaf[J]. PLoS Biol， 2008， 6（7）： e174.

[5] Bartholomew D P， Paull R E， Rohrbach K G. The pineapple： botany， production， and uses[M]. Wallingford， UK： CABI， 2003.

[6] Li Y H， Zhang Z， Sun G M. Changes in cell number and cell size during pineapple（Ananas comosus L.）fruit development and their relationship with fruit size[J]. Aust J Bot， 2010， 58（8）： 673-678.

[7] Chappell J. The biochemistry and molecular biology of isoprenoid metabolism[J]. Plant Physiol， 1995， 107： 1-6.

[8] Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosynthetic pathway in plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1995， 46（1）： 521-547.

[9] McGarvey D J， Croteau R. Terpenoid metabolism[J]. Plant Cell， 1995， 7（7）： 1 015-1 026.

[10] Learned R M， Fink G R. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from Arabidopsis thaliana is structurally distinct from the yeast and animal enzymes[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1989， 86（8）： 2 779-2 783.

[11] Cowan A K， Moore-Gordon C S， Bertling I， et al. Metabolic control of avocado fruit growth（isoprenoid growth regulators and the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase）[J]. Plant Physiol， 1997， 114（2）： 511-518.

[12] Lange B M， Rujan T， Martin W， et al. Isoprenoid biosynthesis： the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97（24）： 13 172-13 177.

[13] Narita J O， Gruissem W. Tomato hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is required early in fruit development but not during ripening[J]. Plant Cell， 1989， 1（2）： 181-190.

[14] Rui X， Caiqin L， Wangjin L， et al. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1（HMG1）is highly associated with the cell division during the early stage of fruit development which determines the final fruit size in Litchi chinensis[J]. Gene， 2012， 498（1）： 28-35.

[15] Ezura H， Hiwasa-Tanase K. Fruit development[M]. // Pua E C， Davey M R（eds）. Plant developmental biology - biotechnological perspectives， vol 1. Springer， Berlin， 2010： 301-318.

[16] Kobayashi T， Kato-emori S， Tomita K， et al. Transformation of tomato with the melon 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase leads to increase of fruit size[J]. Plant Biotech， 2003， 20（4）： 297-303.

[17] Omura T， Watanabe S， Iijima Y， et al. Molecular and genetic characterization of transgenic tomato expressing 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase[J]. Plant Biotechnol， 2007， 24（1）： 107-115.

[18] Paroussi G， Voyiatzis D G， Paroussis E， et al. Growth， flowering and yield responses to GA3 of strawberry grown under different environmental conditions[J]. Sci Hort， 2002， 96（1）： 103-113.

[19] Shargal A， Golobovich S， Yablovich Z， et al. Synthetic cytokinins extend the phase of division of parenchyma cells in developing pear（Pyrus communis L.）fruits[J]. J Hortic Sci Biotechnol， 2006， 81（5）： 915-920.

[20] 方金豹， 黃宏文， 李紹華. CPPU對獼猴桃果實發(fā)育過程中糖、酸含量變化的影響[J]. 果樹學報，2002，19（4）： 235-239.

[21] 范國榮， 肖會員， 劉善軍， 等. N-（2-氯-4-吡啶基）-N'-苯基脲（CPPU）對甜柿果實中淀粉、 還原糖含量和淀粉酶活性的影響[J]. 植物生理學通訊， 2006， 42（3）： 454-456.

[22] Hamada K， Hasegawa K， Ogata T. Strapping and a synthetic cytokinin promote cell enlargement in ‘Hiratanenashi Japanese persimmon[J]. Plant Growth Regul， 2008， 54（3）： 225-230.

[23] 李運合， 孫光明. 噴施外源CPPU和GA對菠蘿果實品質的影響[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（9）： 1 252-1 255.

[24] Boyce R， Chilana P， Rose T M. iCODEHOP： a new interactive program for designing COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers from multiply aligned protein sequences[J]. Nucleic Acids Res， 2009， 37： W222-W228.

[25] Fu X， Deng S， Su G， et al. Isolating high-quality RNA from mangroves without liquid nitrogen[J]. Plant Mol Biol Rep， 2004， 22（2）： 197-197.

[26] Li Y H， Wu Q S， Huang X， et al. Molecular cloning and characterization of four genes encoding ethylene receptors associated with pineapple（Ananas comosus L.）flowering[J]. Front Plant Sci， 2016， 7： 710.

[27] Li Y H， Wu Y J， Wu B， et al. Exogenous gibberellic acid increases the fruit weight of ‘Comte de Paris pineapple by enlarging flesh cells without negative effects on fruit quality[J]. Acta Physiol Plant， 2011， 33（5）： 1 715-1 722.