硅與青枯菌互作對(duì)茄子幼苗抗氧化酶活性的影響

李威　高曉敏　肖熙鷗　李可　呂玲玲

摘 要 以抗性不同的2個(gè)茄子品種為試材，通過水培試驗(yàn)，探討青枯菌侵染下外源硅對(duì)茄子青枯病的抗性及抗氧化酶活性的影響，為茄子青枯病的預(yù)防提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：Si+Rs可顯著降低病情指數(shù)，同時(shí)，顯著提高茄子根系活力；對(duì)于感病品種而言，接菌前，加硅與否對(duì)茄苗葉片中的PAL和PPO活性無顯著影響，接菌后，Si+Rs的PAL和PPO活性顯著高于Rs；而在抗病品種中，不論接菌與否，加硅處理的茄苗葉片中PAL和PPO活性均顯著高于不加硅處理。說明施加外源硅能提高葉片中相關(guān)抗氧化酶活性并增強(qiáng)茄子對(duì)青枯病的抗性。

關(guān)鍵詞 硅；青枯??；茄子幼苗；抗病性；抗氧化酶活性

中圖分類號(hào) S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

青枯病是一種由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的主要作用于茄科作物的細(xì)菌性土傳病害，能侵染450多種單子葉和雙子葉植物[1]。茄子生產(chǎn)中，該病在高溫高濕、土壤酸化、連作等條件下極易大面積發(fā)生，已成為影響茄子生產(chǎn)的主要病害，并有向溫帶區(qū)域蔓延的趨勢(shì)。青枯病病原菌變異大，寄主范圍廣，至今尚無有效的防治辦法[2]。由于該病原菌變異快、生理小種多，導(dǎo)致抗病品種抗性易喪失且生產(chǎn)中的抗病品種難以達(dá)到抗病性與豐產(chǎn)性的統(tǒng)一，故抗病育種難度大，生產(chǎn)中可供選擇的抗病品種少；化學(xué)防治的效果差且易對(duì)土壤環(huán)境和食品安全產(chǎn)生較大的影響；而生物防治存在田間防效不穩(wěn)定的現(xiàn)象，至于其他防治措施也存在一定的局限，均不能滿足生產(chǎn)的需求。因此，繼續(xù)探究其他有效措施防治青枯病成為茄科作物生產(chǎn)的重要工作。

對(duì)植物正常生長(zhǎng)而言，硅雖不是高等植物生長(zhǎng)的必需元素，但對(duì)植物在逆境中的抗性有重要影響[3]。已有的研究結(jié)果表明，外源硅可提高多種植物對(duì)病害的抗性，如黃瓜炭疽病[4]、小麥白粉病[5]、水稻稻瘟病[6]、番茄根腐病[7]和香蕉黑葉斑病[8]等。Dannon[9]研究發(fā)現(xiàn)，硅的施用能緩解番茄青枯病的危害，感病和抗病品種的發(fā)病率分別降低26.8%和56.1%；同時(shí)，Diogo等[10]的試驗(yàn)結(jié)果也表明，硅對(duì)青枯病的防治效果能達(dá)到38.1%～100%。Ghareeh[11]認(rèn)為，青枯菌侵染番茄后，外源硅可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性信號(hào)分子，增加與防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抗性有關(guān)的茉莉酸/乙烯標(biāo)記基因（JERF3，TSRF1 and ACCO）氧化脅迫標(biāo)記基因（FD-I and POD）的表達(dá)；增加了PGK、TUB和ACT這3個(gè)看家基因的表達(dá)，提高植株的逆境耐受能力[12]。目前，有關(guān)硅與茄科作物青枯病抗性的關(guān)系的研究主要集中在番茄上，對(duì)于木質(zhì)化程度更高的茄子還少有研究；同時(shí)，以往相關(guān)的研究結(jié)果多集中于硅對(duì)青枯病的抗病效果及誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響，而對(duì)于植物生理生態(tài)的影響涉及較少。本研究通過接種青枯菌和施加外源硅，從葉片相關(guān)防御酶和根系活力的變化等角度探究硅元素對(duì)茄子青枯病抗性的影響，擬為生產(chǎn)上茄子青枯病的防治提供有效途徑和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茄子品種為13號(hào)（特亮紫光）和49號(hào)（泰茄一號(hào)），其中13號(hào)為高感青枯病品種；而49號(hào)為中抗青枯病品種。供試青枯菌菌種從大田茄子青枯病發(fā)病植株中分離獲得，為生理小種1 生化型Ⅲ。

1.2 方法

1.2.1 水培 將催芽露白的茄子種子播于水培箱中并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：晝夜溫度28 ℃（14 h）/25 ℃（10 h），光照強(qiáng)度為200 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度為80%。待茄子幼苗長(zhǎng)至3葉一心時(shí)，分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移栽至塑料杯中，每個(gè)塑料杯中定植一株茄苗并澆灌營(yíng)養(yǎng)液40 mL，用陶粒作為栽培介質(zhì)進(jìn)行固定。營(yíng)養(yǎng)液參照Hoagland經(jīng)典配方配制[13]，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為：（1）接菌加硅（Rs+Si）；（2）接菌不加硅（Rs）；（3）不接菌加硅（Si）；（4）不接菌不加硅（CK）。每個(gè)處理30株，3次重復(fù)。添加的硅為K2SiO3（分析純），濃度為1.5 mmol/L（此濃度是在另一個(gè)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的，由于該試驗(yàn)結(jié)果還未發(fā)表，故無法標(biāo)注該濃度的引用出處），即不加硅處理的營(yíng)養(yǎng)液中通過添加3.0 mmol/L的氯化鉀來補(bǔ)充由于施硅帶來的鉀。各處理的試驗(yàn)材料分別用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)20 d后進(jìn)行接種。接種方法為傷根侵染法，接種青枯菌的菌液濃度為4×108 CFU/mL，未接菌處理則用蒸餾水代替。在接菌第2天后開始觀察不同處理茄子幼苗的萎蔫癥狀并分級(jí)，計(jì)算病害指數(shù)，直至植株枯死為止，調(diào)查期間正常管理；同時(shí)，于接種后的0、1、3、5、7、9、11 d分別取不同處理的茄子根尖部位測(cè)定根系活力并分別取各處理植株的倒2葉用于測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的活性。

1.2.2 測(cè)定方法及指標(biāo) 病情指數(shù)的計(jì)算：根據(jù)劉富中等[14]的方法，可將茄子幼苗青枯病發(fā)病情況分為5級(jí)。0：無癥狀；1：1片葉萎蔫；2：2片葉萎蔫；3：3片及3片葉以上萎蔫；4：植株完全死亡。病情指數(shù)計(jì)算公式為：

DI=∑（病級(jí)×該病級(jí)株數(shù)）/（最高病級(jí)×調(diào)查株數(shù)）×100%。

茄子幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定：（1）根系活力的測(cè)定，茄子幼苗根系活力的測(cè)定采用三苯基四氮唑法（TTC）[15]。（2）PAL及PPO酶活性采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅處理對(duì)茄子青枯病病情指數(shù)的影響

硅和青枯菌對(duì)茄子青枯病病情指數(shù)的影響見圖1。由圖1可知，Si+Rs對(duì)2個(gè)不同抗性品種茄苗的青枯病病害指數(shù)均有較大的影響。對(duì)于感病品種13（a）而言，在接菌9 d后，Rs的茄苗的病害指數(shù)即達(dá)到100%，而Si+Rs僅為49.78%；Si+Rs能明顯的降低中抗品種49（b）的青枯病病情指數(shù)且推遲發(fā)病時(shí)間，在接種11 d后，其病情指數(shù)僅為20.61%，較Rs低16.91%。

2.2 不同處理對(duì)茄子幼苗根系活動(dòng)的影響

根系是植物與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的重要部位，植物根系活力的高低直接影響植物的生長(zhǎng)。因此，根系活力可作為評(píng)判植物生長(zhǎng)狀況和潛力的重要生理指標(biāo)。從圖2（a）中可知，接菌前，加硅與否均對(duì)茄苗根系活力均無顯著影響。接菌1 d后，Si+Rs的根系活力略有升高，而Rs的根系活力降低；接菌3 d至11 d后，Si+Rs與Rs的茄苗根系活力均大幅度下降，其中接菌5 d后的降幅最大，在此期間，Si+Rs的根系活力在同一接種時(shí)期均分別高于Rs，而CK和Si的根系活力均保持穩(wěn)定。

對(duì)于中抗品種49而言，根系活力在Si+Rs和Rs中均呈下降趨勢(shì)且Rs的根系活力始終低于Si+Rs；而CK和Si的根系活力均保持較高水平。在不同抗性的兩個(gè)品種中，Si的根系活力總是高于CK，自接菌3 d后，不論加硅與否，中抗品種49的根系活力始終高于感病品種13號(hào)。

2.3 不同處理對(duì)茄苗PAL活性的影響

從圖3（a）可知，未接種前，加硅與否對(duì)茄子葉片的PAL酶活性無顯著影響。接菌1 d后，Si+Rs與Rs的葉片PAL酶活性均迅速升高；至接菌3 d后，二者的PAL酶活性均達(dá)到峰值且Si+Rs酶活性顯著高于Rs；至接菌9 d后，Rs的酶活性急劇下降，顯著低于其他處理，而Si+Rs仍保持較高活性；接菌11 d后，其酶活性為Si>CK>Si+Rs>Rs且各處理間差異顯著。

未接種前，中抗品種（b）的PAL酶活性表現(xiàn)為Si顯著高于CK；接菌1 d后，4個(gè)處理的酶活性均達(dá)到峰值且酶活性均呈現(xiàn)顯著性差異，表現(xiàn)為Si+Rs>Rs>Si>CK；隨后各處理的酶活性開始下降，以Si+Rs的酶活性降幅最小且保持在較高的水平；至接菌11 d后，Rs的酶活降至最低，僅有20.98 U/g，為Si+Rs活性的62.53%，顯著低于其他處理。

2.4 不同處理對(duì)茄苗PPO活性的影響

從圖4（a）中可知，未接種前，4個(gè)處理的茄苗葉片中PPO活性均較低且差異不顯著；在接種1 d后，4個(gè)處理的酶活性均達(dá)到峰值，Si+Rs與Rs的酶活性均迅速升高，增幅分別高達(dá)121.26%和78.16%，兩處理的酶活性差異達(dá)顯著水平，Si的酶活性也高于CK；隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)處理的酶活性均處于下降趨勢(shì)，其酶活性為Si+Rs>Rs>Si>CK；至接種11 d后，Si+Rs與Rs的酶活性均顯著低于對(duì)照。

在圖4（b）中，接種前，加硅處理的酶活性均顯著高于不加硅處理；在接種1 d后，4個(gè)處理的酶活性均快速上升達(dá)到峰值，尤以Si+Rs增幅最大，其次為Rs，CK增幅最??；在接種3～7 d后，4個(gè)處理的酶活性均出現(xiàn)下降，其酶活性為Si+Rs>Rs>Si>CK且Si+Rs的酶活性降幅最小并仍保持較高的活性。接種11 d后，Si+Rs的酶活性仍處于較高水平且顯著高于其他處理，而Rs的酶活性降至最低，顯著低于對(duì)照。對(duì)于2個(gè)抗性不同的品種而言，同一時(shí)期，經(jīng)Si+Rs處理的中抗品種的酶活性增幅均要高于感病品種，且在接種后其酶活性能保持較長(zhǎng)時(shí)間。

3 討論

目前，有關(guān)硅能提高植物抗病性的研究多聚焦于硅對(duì)水稻紋枯病[16]、小麥白粉病[5]、豇豆銹病[17]等真菌病害的抑制作用，而關(guān)于硅對(duì)茄科細(xì)菌性病害青枯病的研究亦逐步開展并主要以番茄為研究材料。Dannon和Wydra[9]研究發(fā)現(xiàn)，施硅能緩解番茄青枯病的危害，感病和抗病品種的發(fā)病率分別降低26.8%和56.1%。Diogo和Wydra[10]的試驗(yàn)則表明，硅對(duì)青枯病的防治效果能達(dá)到38.1%～100%。本研究結(jié)果表明，加硅處理（Si+Rs）可顯著降低感病品種茄子幼苗的青枯病發(fā)病指數(shù)，同時(shí)，可推遲中抗品種的青枯病發(fā)病指數(shù)并顯著降低發(fā)病率。而Getachew等[18]認(rèn)為，加硅處理只對(duì)中抗番茄品種有顯著的抗病及增產(chǎn)效果，但對(duì)中感青枯病的番茄品種的則抗病效果及豐產(chǎn)效果均不明顯，這一結(jié)果與本研究的結(jié)論略有不同，可能因?yàn)樵囼?yàn)材料的差異造成。

根系吸收一定的硅素后，能使根系細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量增多，有利于氧化磷酸化的進(jìn)行，使根的呼吸速率和ATP的含量增加，促進(jìn)根系組織生長(zhǎng)發(fā)育。在關(guān)于硅對(duì)四棱豆[19]和蕎麥[20]的研究中，施用一定濃度的硅可顯著提高四棱豆和蕎麥幼苗根系活力，但硅對(duì)調(diào)節(jié)干旱脅迫下四棱豆及蕎麥的根系活力的效果均存在劑量效應(yīng)。黃益宗等[21]研究認(rèn)為，在鹽脅迫下，外源硅可顯著提高鹽脅迫下2種水稻的根系活力，與不加硅的對(duì)照相比，添加1.0 mmol/L的Si可分別使野生型和突變體水稻根系活力指數(shù)提高60.47%和42.42%。對(duì)高粱根系的研究表明，加硅可以提高根尖端和近尖端細(xì)胞壁的彈性和粘性，從而促進(jìn)根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，提高根系活力[22]。本研究中，接菌加硅處理的茄苗根系活力顯著高于接菌不加硅處理并能保持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，與四棱豆、蕎麥及水稻的結(jié)果一致。這一現(xiàn)象可能是由于根系吸收外源硅后在根表皮細(xì)胞富集，形成物理屏障角質(zhì)-硅雙層而阻止病菌的入侵，從而延緩青枯菌的侵染并在一定程度上保護(hù)了根表皮細(xì)胞，導(dǎo)致接種青枯菌后，較不加硅處理仍能保持較高的活力。

植物在受到脅迫時(shí)，硅可能通過調(diào)控植物體相關(guān)的生理生化反應(yīng)并誘導(dǎo)植物組織中病程相關(guān)蛋白酶活性而產(chǎn)生一系列的抗性反應(yīng)。PAL和PPO是植物體重要的相關(guān)防御酶，二者的酶活性與植物抗逆性密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)植物對(duì)逆境抗性能力的重要指標(biāo)。如黃瓜接種腐霉菌后，硅處理的植株病情指數(shù)較低，同時(shí)，POD和 PPO活性增強(qiáng)的遠(yuǎn)高于對(duì)照[23]。Cai等[6]和孫萬春等[24]研究亦發(fā)現(xiàn)水稻感染稻瘟病后，硅處理可顯著增加水稻葉片中過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶的活性。王蕾等[25]以番茄為試材，研究外源硅對(duì)接種青枯病的番茄葉片抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明，青枯菌侵染條件下硅處理能顯著增加番茄葉片抗氧化酶活性，同時(shí)，顯著降低了番茄的青枯病發(fā)病指數(shù)。本研究結(jié)果表明，對(duì)于感病品種而言，接菌前，加硅與否對(duì)茄苗葉片中的PAL和PPO活性無顯著影響，接菌后，加硅處理的PAL和PPO酶活性顯著高于不加硅處理；而在抗病品種中，不論接菌與否，加硅處理的茄苗葉片中PAL和PPO活性均顯著高于不加硅處理，這與前人研究結(jié)論一致。

綜上表明，外源硅可顯著降低不同抗性茄子幼苗的青枯病病情指數(shù)，同時(shí)，顯著提高茄苗根系活力及葉片中PAL和PPO抗氧化酶活性，進(jìn)而提高茄子對(duì)青枯病的抗性，這一結(jié)果可能是硅在植物體中發(fā)揮物理機(jī)械屏障作用[26]和誘導(dǎo)植物組織中病程相關(guān)蛋白酶活性[27]的綜合結(jié)果。

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