低pH和鋁脅迫對胡椒根細胞存活和有機酸分泌的影響

祖超　楊建峰　李志剛　王燦　魚歡　鄔華松

摘 要 以胡椒插條苗為研究對象，通過在低pH和正常pH營養(yǎng)液中添加不同濃度鋁，研究胡椒根系細胞存活和有機酸分泌對低pH和鋁脅迫的響應。結(jié)果表明：pH5.0（低pH）條件下，不添加鋁時，胡椒根細胞即表現(xiàn)出壞死癥狀，當添加80 μmol/L鋁時，胡椒根細胞開始凋亡，200 μmol/L鋁添加導致胡椒根細胞全部死亡；pH6.0（正常pH）條件下，當添加80 μmol/L鋁時，胡椒根細胞出現(xiàn)壞死癥狀，200 μmol/L鋁添加導致根尖細胞大量凋亡。由此可見，低pH和鋁的雙重脅迫加速胡椒根細胞凋亡。低濃度鋁添加致使胡椒根系分泌有機酸速率增加，檸檬酸為胡椒適應低pH和鋁脅迫分泌的主要有機酸；在低pH和正常pH條件下，40 μmol/L鋁添加均可誘導胡椒根系檸檬酸分泌速度的增加，蘋果酸僅在正常pH條件下低濃度鋁脅迫時分泌速率增加。因此，低pH條件下，鋁脅迫引起胡椒根系分泌有機酸種類減少，分泌速率降低。研究還發(fā)現(xiàn)Al3+是對胡椒毒害最嚴重的鋁形態(tài)，是pH<4.5土壤中的主要鋁形態(tài)，目前海南省胡椒主要植區(qū)有50%的土壤pH低于4.5，所以對于胡椒園土壤的鋁毒害應引起足夠重視。

關(guān)鍵詞 胡椒；低pH；鋁脅迫；根系；有機酸

中圖分類號 S153.4 文獻標識碼 A

鋁脅迫是酸性土壤或酸化土壤上作物生長最重要的限制因素[1]。自1980年至2000年，無機肥料的大量施用，導致中國土壤酸化加劇，酸化嚴重的南方地區(qū)經(jīng)濟作物種植區(qū)pH下降了0.3個單位[2]。對中國胡椒主產(chǎn)區(qū)海南省的胡椒主要種植區(qū)土壤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，pH低于4.5和pH在4.5到5.5之間的土壤各占50%，顯著低于胡椒適宜生長的土壤pH范圍5.5～7.0[3]，長期生長于該區(qū)域的胡椒已明顯表現(xiàn)出早衰癥狀[4]。而且胡椒長期連作會顯著降低胡椒園土壤pH[5]，胡椒種植于pH<5.5的土壤上，胡椒蔓的生長受鋁毒抑制，胡椒主蔓由綠變黃，葉片枯萎、根系死亡[6]。鋁毒害的最初癥狀是抑制根系生長，對地上部的毒害是對根系毒害的間接傷害[7]，因此，研究低pH和鋁對胡椒的毒害作用應從根系研究開始。酸性土壤上種植胡椒，根系生長受到抑制[5]，是低pH的作用或者鋁的作用，還是二者的共同作用，有待研究。

植物在受到低pH和鋁雙重脅迫時，會通過體外排斥和體內(nèi)忍耐2種機制來減緩鋁毒害。前者主要包括：細胞壁對鋁的固定、升高根際pH、分泌磷酸、黏液和有機酸陰離子等。體內(nèi)忍耐機制主要是吸收到植物體內(nèi)的鋁離子被檸檬酸、草酸等有機酸螯合后貯存于液泡中[8-9]。玉米耐性品種的根冠細胞釋放檸檬酸量是敏感品種的幾倍[10]；耐鋁小麥品種的根尖比敏感品種釋放出多5～10倍的蘋果酸[11]；抗鋁蕎麥分泌草酸[12]。有機酸在細胞內(nèi)或細胞外螯合了鋁，使鋁失去活性，從而減輕了鋁毒。但對胡椒根系如何適應低pH和鋁的雙重脅迫，目前未見相關(guān)報道。因此，本文通過研究低pH和鋁對胡椒根系影響，分析了低pH下鋁毒害對胡椒根系質(zhì)子和有機酸陰離子分泌的影響，探明低pH和鋁雙重脅迫條件下胡椒根系生理適應機理，為深入理解低pH和鋁脅迫條件下的根際過程以及植物抗酸鋁脅迫的機制，進而進行深層土壤改良提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取在沙池中培養(yǎng)30 d長勢一致的胡椒（Piper nigrum L. cv. Reyin No. 1）插條苗，用去離子水將根系沖洗干凈，稱重后移至1 L的不透光玻璃桶中，通過營養(yǎng)液培養(yǎng)來研究低pH和鋁對胡椒根系生理的影響及適應機理。培養(yǎng)條件：溫度27 ℃，光照強度150 μmol/（m2·s），光照時間12 h/d，培養(yǎng)時間為12 d。

1.1.2 不同處理 試驗分別設(shè)置2個pH（5.0、6.0）和4個鋁濃度（AlCl3）（40、80、120、200 μmol/L）處理，每個處理6個重復，觀察pH和鋁的毒害癥狀，培養(yǎng)12 d后測定酸鋁對胡椒根系活力和有機酸分泌的影響。營養(yǎng)液按以下組分和濃度配成（μmol/L）：K2SO4（750），MgSO4（650），KCl（100），KH2PO4（250），Ca（NO3）2（2000），F(xiàn)e-EDTA（100），H3BO3（100），MnSO4（1），ZnSO4（1），CuSO4（0.1），（NH4）6Mo7O24（0.005）[5]。每5天更換1次營養(yǎng)液，晝夜連續(xù)通氣，每天用0.1 mmol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH至相應處理閾值。

1.2 方法

1.2.1 根表皮細胞存活性的測定 取20 μL的PI母液（CyStainR PI Absolute P，sysmex partec）加入到1.5 mL高純水中，配制成一定濃度的 PI 染色劑，均勻混合。用手術(shù)刀片切取相同直徑的胡椒插條苗根段（自根末稍開始到根基部方向長度為2 cm，直徑指根段的根基部方向一端的直徑），用1 mL的移液器將根段的分泌物吸取干凈，然后用吸水紙吸干，在環(huán)境溫度27 ℃下，將植物材料放到高純水中清洗3遍，每次清洗后都用吸水紙吸干，然后將不同處理的根段分別放入PI染色劑中，100 r/min的搖床上染色，染色時間為60 min，染色后的各根段放到高純水中，100 r/min的搖床上漂洗20 min。將各根段放到載玻片上，滴2～3滴高純水，蓋上蓋玻片在正立熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51， Japan）下，采用WG熒光通道觀測，可以觀測到PI發(fā)射出的紅色光[13]。

1.2.2 有機酸收集與測定 在pH分別為5.0和6.0的營養(yǎng)液中培養(yǎng)12 d的胡椒苗用去離子水洗凈，然后將苗放于不同鋁濃度的0.5 mmol/L CaCl2收集液中，處理時間為6 h，處理完后取收集液100 mL，加入2滴濃磷酸，-20 ℃冰箱中冷凍，后放于錫箔紙上凍干儲存于-20 ℃冰箱中，待測與鋁脅迫相關(guān)的檸檬酸、蘋果酸、草酸和順烏頭酸4種有機酸。將錫箔紙剪碎，放入30 mL瓶中，加入15 mL去離子水中，超聲30 min浸提。取適量浸提液過0.45 μm濾膜，待測。有機酸組分及含量使用高效液相色譜測定，流動相為pH=2.7，濃度為10 mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液，流速0.8 mL/min，紫外檢測器214 nm，柱溫35 ℃[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用SPSS 13.0和SAS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低pH和鋁脅迫下胡椒主要癥狀

胡椒根系最先表現(xiàn)出酸鋁脅迫癥狀。酸鋁脅迫根系生長時，吸收根的根尖先變黑，而后延伸到整條根變黑，pH為5和6處理的植株，用鋁濃度為40 μmol/L的收集液處理6 h，然后重新放置于無鋁營養(yǎng)液中培養(yǎng)，根系即出現(xiàn)毒害癥狀（圖1-A），隨著脅迫時間延長，葉片的葉緣和葉尖慢慢變黑直至整片葉子變黑脫落（圖1-B）。pH為5和6處理的植株，在鋁濃度高于80 μmol/L的收集液中處理6 h后，放回營養(yǎng)液中培養(yǎng)，地上部葉片即出現(xiàn)變黑脫落癥狀（圖1-B）。

2.2 酸鋁對胡椒根表細胞存活的影響

正常細胞和凋亡細胞在不固定的情況下對PI拒染，壞死細胞因細胞膜不完整性，PI可進入細胞與DNA結(jié)合，使細胞著色。不加鋁條件下，pH為5的低pH處理下胡椒根尖已表現(xiàn)出壞死癥狀，被染色細胞明顯多于正常pH處理（圖2-a），在pH為6的正常酸度條件下，胡椒根系呈暗紅色，根尖對PI拒染（圖2-b）；在鋁濃度為40 μmol/L，pH為5條件下，根尖細胞被染為亮紅色，根系壞死癥狀加?。▓D2-c），pH為6條件下，根系仍呈暗紅色，只是相對于不加鋁處理壞死細胞增多（圖2-d）；當鋁濃度為80 μmol/L，pH為5條件下，根尖細胞開始凋亡（圖2-e），pH為6條件下，根尖被染細胞增多，壞死程度加?。▓D2-f）；鋁濃度為120 μmol/L，pH為5條件下，胡椒根系細胞大多數(shù)已凋亡（圖2-g），pH為6條件下，亮度增加最大，根尖壞死細胞數(shù)目最多（圖2-h）；鋁濃度為200 μmol/L，pH為5條件下，根尖細胞已完全凋亡（圖2-i），pH為6條件下，根尖細胞大部分凋亡（圖2-j）。

2.3 低pH和鋁對胡椒根系有機酸分泌的影響

為了研究低pH和鋁毒對胡椒有機酸分泌的交互作用，本試驗研究了長期低pH和短期鋁毒處理對胡椒有機酸分泌速度的影響。從圖3-A可以看出，胡椒在低pH和正常pH條件下生長12 d后，低pH和正常pH生長條件下的胡椒根系都有檸檬酸分泌，但低pH處理下，檸檬酸分泌速度比正常pH處理低62.50%。用不同濃度鋁處理6 h后，低pH和正常pH條件下，相對于無鋁對照，40 μmol/L鋁濃度處理使得檸檬酸分泌速度分別增加了147.06%和28.68%，80、120、200 μmol/L的鋁濃度處理都沒有顯著提升檸檬酸分泌速度，而且，在正常pH條件下，120 μmol/L和200 μmol/L高鋁濃度處理下，檸檬酸分泌速度還被顯著抑制，分別比對照降低了64.71%和77.21%。胡椒在低pH和正常pH情況下生長12 d后，不加鋁對照有蘋果酸分泌。低pH條件下，采用不同鋁濃度處理胡椒，發(fā)現(xiàn)并沒有影響蘋果酸分泌速度，正常pH條件下，40 μmol/L AlCl3處理可以顯著提高蘋果酸分泌速度，比對照提高186.54%，高濃度鋁處理不僅不會提升蘋果酸分泌速度，還有抑制作用（圖3-B）。低pH條件下，鋁毒沒有顯著提高草酸分泌速度，正常pH條件下，低濃度鋁處理（40 μmol/L）可以提高草酸分泌速度，高濃度鋁處理會降低草酸分泌速度（>80 μmol/L）（圖3-C）。低pH條件下，順烏頭酸分泌速度不受鋁濃度大小的影響，正常pH條件下，40 μmol/L濃度處理使順烏頭酸分泌速度相對于不加鋁的處理提高了308.70%，其余鋁濃度處理對順烏頭酸分泌速度沒有顯著影響（圖3-D）。

綜上所述，低pH條件下，低濃度鋁脅迫誘導胡椒根系分泌大量檸檬酸，高濃度鋁脅迫則抑制有機酸分泌，對蘋果酸、草酸和順烏頭酸沒有顯著誘導；正常pH條件下低濃度鋁脅迫可以誘導胡椒根系分泌檸檬酸、蘋果酸、草酸和順烏頭酸，高濃度鋁脅迫則抑制幾種有機酸的分泌。這可能與低濃度鋁誘導胡椒啟動體外分泌有機酸排斥機制，高濃度鋁導致根細胞壞死或者凋亡無法啟動體外排斥機制有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

pH有很微小的變化也會影響到鋁形態(tài)[15]。本研究中，pH為5.0和6.0條件下，采用40 μmol/L的鋁處理6 h后pH分別變?yōu)?.91和5.14，pH為4.91時根系染色亮度明顯高于pH為5.14的，可見胡椒根系對Al3+的敏感程度高于Al（OH）2+[16]，這與已有研究認為的大豆等雙子葉植物對Al（OH）2+和Al（OH）2+的敏感程度要高于Al3+不同[17]，具體原因有待進一步研究；采用80 μmol/L的鋁處理6 h后，pH分別變?yōu)?.49和4.65，pH為4.49條件下，胡椒根系細胞已經(jīng)開始凋亡，有可能是多核Al13的作用，因為已有研究表明，pH為4.5時形成多核Al13，此時，Al13毒害作用極強，對根伸長速率的抑制作用顯著高于其他形態(tài)鋁[18]；采用120 μmol/L的鋁處理6 h后，pH分別變?yōu)?.24和4.27，pH為4.24條件下的根尖細胞大部分凋亡，但是pH為4.27條件下根尖細胞染色亮度顯著增大，與pH為5時給予40 μmol/L的鋁處理現(xiàn)象相似，可見，前期的低pH處理已脅迫根系生長，使得pH為5條件下采用120 μmol/L的鋁處理，根尖細胞即出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象，在不加鋁的條件下pH為6時胡椒可以正常生長，所以，用濃度為120 μmol/L的鋁處理6 h，胡椒根系細胞未出現(xiàn)大量凋亡。當采用200 μmol/L的鋁處理6 h后，pH為5和6的培養(yǎng)液pH分別變?yōu)?.81和4.02，此時鋁形態(tài)主要為Al3+，低pH處理的根系，根尖細胞全部凋亡，而正常pH培養(yǎng)的胡椒，根尖開始凋亡，該處理條件下，胡椒根系表皮細胞死亡率最高，所以Al3+是對胡椒根系脅迫最嚴重的鋁形態(tài)。綜上所述，長期在低pH條件下生長的胡椒，根系易受到鋁脅迫。

2009年時海南省胡椒主要植區(qū)的土壤pH低于4.5的占50%[3]，而且隨著種植年限增加，胡椒園土壤pH顯著降低[5]，本研究發(fā)現(xiàn)鋁濃度為40 μmol/L時，pH為5條件下即出現(xiàn)根尖細胞壞死癥狀，目前測定中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所胡椒試驗基地12、23、28、38 a胡椒園土壤鋁含量的平均值為7.6%，而中國土壤鋁含量的平均值為3.8%，胡椒園土壤鋁含量是中國土壤鋁含量平均值的2倍，這在酸化土壤中應引起足夠重視。

許多植物通過分泌檸檬酸、蘋果酸、草酸來抵御鋁毒脅迫[8，19]，低濃度鋁脅迫可以使胡椒根系分泌這幾種有機酸的速度增加，可見，低濃度鋁可以誘導胡椒啟動體外排斥機制；高濃度鋁脅迫則抑制幾種有機酸的分泌，通過分析低pH和鋁毒害對根細胞存活的影響發(fā)現(xiàn)高濃度鋁脅迫胡椒根系使根系細胞壞死或者凋亡，這就使得高濃度鋁脅迫胡椒根細胞壞死或者凋亡降低了有機酸分泌速度。所以，胡椒可以通過分泌有機酸來抵御低濃度鋁脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)無論在低pH還是正常pH條件下，40 μmol/L的低鋁濃度都能誘導胡椒根系分泌檸檬酸速度顯著增加，但是對其他幾種有機酸分泌速度的影響大小不一，所以，檸檬酸是胡椒根系抵御低鋁濃度脅迫分泌的主要有機酸。有研究認為，根據(jù)有機酸代謝的三羧酸循環(huán)途徑，鋁誘導檸檬酸分泌，是通過提高檸檬酸合成酶活性，或者降低異檸檬酸合成酶和順烏頭酸合成酶活性來實現(xiàn)的[20-21]。但是本研究發(fā)現(xiàn)低濃度鋁脅迫在正常pH條件下，根系分泌檸檬酸和順烏頭酸的分泌速度均顯著增加，可見鋁毒脅迫胡椒根系分泌檸檬酸并不是通過降低順烏頭酸酶活性以改變代謝途徑來實現(xiàn)的，這與在黑小麥上的研究結(jié)果相同，檸檬酸的分泌速度增加，有可能是檸檬酸運輸?shù)鞍谆蛟阡X誘導下上調(diào)所致[22]。pH為5.0時，加鋁和不加鋁條件下都有蘋果酸、草酸和順烏頭酸分泌，并沒有影響這幾種有機酸的分泌速度，pH為6.0時，低鋁濃度誘導檸檬酸、蘋果酸和順烏頭酸分泌速度增加，可見，低pH抑制鋁對蘋果酸和順烏頭酸的誘導，使鋁脅迫加劇，具體抑制機理尚不清楚，還需進一步研究。

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