臭參活性成分乙酸乙酯部分的分離

欒云鵬　王啟明

摘 要 此實驗的目的：分離臭參中主要的活性成分。方法：先用95%乙醇初步提取在經過石油醚、乙酸乙酯萃取，把得到的乙酸乙酯萃取的部分用氯仿——甲醇梯度洗脫（100：0～70：30）。結果：乙酸乙酯萃取的部分洗脫出A、B、C、D共4個部分。

關鍵詞 臭參 活性成分 乙酸乙酯 分離

中圖分類號：R284.2?文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.01.073

Separating the Active Ingredient Ethyl Smelly Reference Section

LUAN Yunpeng， WANG Qiming

Abstract The purpose of the experiment： the separation of smelly and the activity of the main ingredients. Methods： preliminary extraction with 95% ethanol by petroleum ether， ethyl acetate extraction， part of the ethyl acetate extract of gradient elution with chloroform， methanol （100：0 ～ 70：30）. Results： ethyl acetate extraction part of the elution of the A， B， C， D， A total of four parts.

Key words smelly and; Active ingredients; Ethyl acetate; separation

臭參為桔梗科（CAMPANULACEAE）黨參屬（Sect. Codonopsis）植物心葉黨參 （Codonopsis cordifolioidea P. C. Tsoong）的根，別名土黨參，棱子黨參，古燈茶根，古東根等，臭參根含有黃酮香豆素、揮發(fā)油、糖、氨基酸、蛋白質、生物堿、有機酸、鞣質、酚類、樹脂和少量皂苷等成分，其中黃酮香豆素為其主要成分之一。①臭參在云南有野生者，家種者，但市售多為家種，其移為家種已有近百年歷史。臭參產量高，價廉，資源十分豐富，每年秋冬季集市上隨處可見，售量相當可觀。臭參在云南具有悠久的應用史和廣泛的群眾應用基礎。臭參的根具有補中益氣，潤肺生津，補肺止咳的功效，在云南作為廉價的滋補品使用，每逢秋冬季節(jié)在蔬菜市場大量銷售，與同屬中藥黨參相比，臭參還具有排除體內積氣的作用，類似“以通為補”。②③

野生植株全體近于光滑無毛或葉片疏生短刺毛。根未見。莖纏繞，長1米以上，直徑約3～4毫米，有少數(shù)極短分枝。主莖上的葉稀疏，互生，兩葉相距約10厘米左右，葉柄線狀，長5～9厘米，葉片闊卵形，甚大，長寬可達10？厘米，頂端短漸尖或急尖，基部近于心形，灣缺方形，葉脈明顯，側脈自基部分出，近全緣，上面綠色，下面灰綠色;短細枝頂端通常僅2葉對生，葉柄較短，長不及1厘米，葉片與主莖上葉片相似，但灣缺不呈方形而遠較細小?；▎紊谌~腋外，花梗與葉互生，長3～6厘米;花萼貼生于子房中部，筒部半球狀，裂片三角狀披針形，長1厘米，寬5～6毫米，頂端漸尖，全緣，灣缺尖狹;花冠鐘狀，長約1.7～1.8厘米，直徑約1～1.2厘米，頂端近于1/2淺裂，裂片披針狀三角形，深藍色;花絲基部擴大，長約5毫米，花藥亦長約5毫米。蒴果下半部半球狀，上部有喙，直徑約1.5厘米。種子多數(shù)，近于橢圓狀，細小，棕色，有不明顯網(wǎng)紋?；ü?～10月。④

1 儀器與材料

儀器：

分析太平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）ISO 9001 京制00000249號 ?c=10d Max220 ?d=0.001g

索氏提取器一套（500ml圓底燒瓶，100ml索氏提取器，配套冷凝管）旋轉蒸發(fā)儀 ?RV8 032014（IKR公司）

MA99-2A自動核酸蛋白分離層析儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）系統(tǒng)配置：HD-2核酸蛋白檢測儀1臺，BS-100A自動部分收集器1臺，BT-100恒流泵1臺，TH-500梯度混合儀1臺，XWT-S臺式記錄儀1臺，標配層析住1套（1.0*40普通層析住1支，1.6*50普通層析住1支，2.5*60中壓層析住1支）50ml的分液漏斗

試劑：

柱層層析硅膠 型號：規(guī)格3，粒度：200～300目，批號：0140015（青島海澤化工廠分廠）

乙醇（95%） 分析純 批號：2013年5月02日 ?執(zhí)行標準：GB/T 679-2002，許可證號：（滇）XK13-011-00001-38（天津市風船化學試劑科技有限公司）

乙酸乙酯 分析純 批號：20140402 ?執(zhí)行標準：GB/T 12589-2007，許可證號：（粵）XK13-011-00005（廣東光華科技股份有限公司）

三氯甲烷 分析純 批號：20121208 ?執(zhí)行標準：GB/T 682-2002，許可證號：（滇）XK13-011-00001-34（云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司）

丙酮 分析純 批號：20111203 ?執(zhí)行標準：GB/T 686-2008，許可證號：（滇）XK13-011-00001-24（云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司）

甲醇 分析純 批號：141225 ?執(zhí)行標準：GB/T 683-2006，許可證號：（川）XK13-011-00015（四川西隴化工有限公司）

石油醚（60～90℃） 批號2013092601 執(zhí)行標準：GB/T15894-2008，許可證號：XK13-201-00306 （四川西隴化工有限公司）。

植物材料：

臭參原材10公斤，市售品，于2015年1月購買，產地云南宜良，農戶栽種品種。

2 提取與分離

2.1 臭參活性成分的提取

從市場上購買的臭參原材10公斤放入-70℃的超低溫冰箱中保存，使用時從超低溫冰箱中取出臭參原材在常溫下解凍，清洗干凈表面泥土，在干燥通風陰暗的環(huán)境下把洗凈的臭參原材表面水分晾干待用。用菜刀把處理好的臭參原材切成片，用分析太平稱取50g用紗布包好放入100ml的索氏提取器中，用量筒量取95%乙醇300ml放入500ml的圓底燒瓶中，安裝好索氏提取器裝置后進行驗漏處理，確認裝置完好、可以正常使用。接通冷凝水，打開水浴鍋加熱，溫度設定為78℃，回流提取3次。取提取液經過旋轉蒸發(fā)儀處理減壓回收溶劑，得到濃縮后的提取物2g。

2.2 臭參活性成分的分離

濃縮后的提取物2g加入10ml蒸餾水懸浮，放入50ml的分液漏斗后加入10ml石油醚（60～90℃）進行萃取，萃取操作為：（1）進行驗漏處理，可以通過對磨砂口涂抹少量凡士林來進行防漏。（2）關閉分液漏斗的閥門，一手緊握閥門防止搖晃時松開、一手用玻璃塞塞緊上出口，水平放置后充分搖晃使里面的兩種互不相融的液體進行充分接觸使萃取物能被萃取液充分的溶解，每搖晃一分鐘左右后應該打開上出口放氣，控制分液漏斗內的氣壓在安全范圍內。萃取搖晃3次后把分液漏斗豎直靜置，直到兩種液體的分界線不再變化為止。（3）打開閥門從下出口放出在下層的液體，上層的液體從上出口放出。把萃取后得到的水部分在用乙酸乙酯10ml進行萃取，得到乙酸乙酯部分和水部分。用得到的乙酸乙酯部分進行梯度洗脫，經氯仿——甲醇（100：0～70：30）梯度洗脫 。

2.2.1 準備工作

（1）把系統(tǒng)電路和液路安裝好。

（2）在斷電情況下，把“濾光片”安裝孔中的檢測波長調整到280nm，換上280nm波長的“濾光片”盒，波長數(shù)字正面向上插入孔中。

（3）打開檢測儀的電源，首先讓檢測儀預熱30-60分鐘。

2.2.2 樣品（液體）流向及管路連接

緩沖液體或樣品→層析住→“進口”（上）→層析?。ㄏ拢鷻z測儀“進”口（下）→檢測儀“出”口（上）→恒流泵→收集試管

2.2.3 系統(tǒng)調試

（1）檢測儀調試。

①儀器預熱30～60分鐘后，可對檢測儀進行調試。

②檢查檢測儀波長是否正確。

③把“靈敏度”選擇為“T”檔，“T”指示燈亮，調節(jié)“T”旋鈕，使“T”為“100”（此時透過率“T”為100%，顯示屏顯示“100”）。

④把“靈敏度”選擇為“1A”檔，“A”指示燈亮，調節(jié)“調節(jié)”旋鈕，使“A”為零（此時透過率“A”為零，顯示屏顯示“0”）。

⑤用分析太平稱取40g柱層層析硅膠（200～300目）于100ml燒杯中，在用量筒量取40ml三氯甲烷加入該燒杯中，用玻璃棒充分攪拌直至溶液中無明顯顆粒狀物，把攪拌充分的溶液裝入到1.6*50普通層析住中，裝柱時要連續(xù)不斷、一氣呵成。裝好后接通恒流泵電源，調節(jié)到1ml/s的流速，使“緩沖液”流過檢測儀“樣品池”進行洗柱，用木棒不斷敲打層析住使里面的氣泡從上方排除。此時調節(jié)“T”旋鈕，使透過率“T”為“100”，調節(jié)“調零”旋鈕，使吸光度“A”為“0”。此時系統(tǒng)達到平衡，樣品流過檢測儀時，電腦根據(jù)樣品濃度繪制圖譜成一條平行于坐標軸橫軸的直線時說明此時柱子已經洗干凈，可以進行上樣檢測。

（2）收集器調試。

①準備工作。將電源線、試管盤、豎桿、安全閥、漏液報警板等正確安裝和固定好。開啟電源，試管盤自動復位至起點，液晶顯示屏亮，全中文顯示。按任意鍵，進入待機狀態(tài)。

②滴頭定位。調節(jié)滴頭到第一個試管的中心位置（外圈第一管），擰緊三個固定螺絲，（豎桿固定螺絲，安全閥固定螺絲，小橫桿固定螺絲），完成滴頭定位。

③參數(shù)設置。設置起始管號和終止管號，設置起始時間和終止時間，設置收集時間1分鐘1管的速度收集。

2.2.4 樣品上樣

當層析住表面的緩沖液快干時用滴管取待測樣品滴加到柱子表面3～4滴即可，等到待測樣品逐漸向下流使柱面快干時加入洗脫液，液面始終保持高于柱面約1ml左右。

關閉梯度混合儀的混合輸出閥門（旋轉方向向左），將濃縮溶液倒入左杯，打開混合閥門（旋轉方向向右），讓溶液經過通道滲入右杯，立即關閉混合閥門。將另一稀釋溶液倒入右杯，使兩杯液位相同，然后在打開混合閥門，使兩液面保持平衡。打開輸出閥門，根據(jù)需要的斜率，緩慢調節(jié)輸出流量。

2.2.5 圖像繪制

如圖1所示，根據(jù)電腦根據(jù)樣品內不同的物質濃度繪制出圖譜（若繪出的圖譜出峰太小，可改變菜單中“靈敏度”選擇），乙酸乙酯部分經氯仿—甲醇梯度洗脫（100：0～70：30），⑤得到A、B、C、D共4個部分。

3 實驗結果

在00：02時出現(xiàn)了一個較高的波峰，說明這個時間出來的物質含量較高。到00：05時又一個較高的波峰，說明此時出來的物質含量很大，到00：06時波峰又達到了頂值，說明此時又有含量很大的物質流出，在00：08時波峰達到頂值，說明有大量的物質流出。到00：14后圖像逐漸形成趨勢于橫軸的直線但存在很多的波動。此次實驗說明了臭參原材在經過索氏提取法提取和萃取后的乙酸乙酯部分分離出了4個部分的活性成分。

注釋

① 李樹幟，葉光正.臭參的初步研究[J].云南中醫(yī)學報，1994.17（4）：17-20.

② Li SZ（李樹幟），Ye GZ （葉光正） 1Preliminary studie s onCodonopsis bulleya na Fore st ex Die ls. J Yunnan Col lege Tra dChin Med.云南中醫(yī)學院學報，1994.17：17220.17-20.

③ Chen ZQ （陳子珺） ，Wei QH （韋群輝） ， Zhou JY （周吉燕） . Re sea rch progre ss of Chou2Shen. Yunna n J Trad ChinMed Ma ter ia Medica （云南中醫(yī)中藥雜志），2006.27：19220.18-21.

④ Codonopsis cordifolioidea Tsoong， Contr. Inst. Bot. Nat. Acad. Peiping 3 （3）： 95. f. 7. pl. 12. 1935; 中國高等植物圖鑒 4： 774， 1975;沈聯(lián)德等，植物分類學報，13（3）：62.1975.

⑤ 梅任強，呂青，胡艷芬，程永現(xiàn).臭參化學成分的研究-天然產物研究與開發(fā)Na tProd ResDev 2010 ，22：2382240文章編號：100126880 （ 2010） 0220238203.