EMS誘變技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

邢飛 王曉雪 任旭東 楊峰 王倫 馬建

摘 要 綜述EMS誘變的原理和關(guān)鍵技術(shù)，簡(jiǎn)述一些EMS誘變技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用。EMS對(duì)水稻成熟胚的愈傷組織的誘變、對(duì)水稻種子的誘變、對(duì)水稻幼穗的突變等；總結(jié)了EMS誘變育種技術(shù)存在缺點(diǎn)和不足；提出了今后EMS誘變技術(shù)應(yīng)用在水稻育種方面的展望和發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 EMS誘變；水稻；育種

中圖分類號(hào)：S336 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2016）06--03

EMS（Ethy Methan Sulfonate）屬于一種烷化試劑，是目前公認(rèn)的一種最為有效且應(yīng)用比較多的化學(xué)誘變?cè)噭MS誘變水稻所產(chǎn)生的突變體，后代分離的基因數(shù)量很少，且穩(wěn)定性較好，但不同的株系之間產(chǎn)生的突變類型比較豐富[1]。當(dāng)前，水稻種質(zhì)資源庫新的基因極其缺乏、遺傳資源日益枯竭的狀態(tài)，采用EMS誘變水稻技術(shù)、創(chuàng)造有用目基因有重要意義。對(duì)水稻分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 EMS誘變的原理

EMS誘變技術(shù)改變DNA的一些結(jié)構(gòu)，通常它帶有一個(gè)或者多個(gè)活性烷基，此烷基可以轉(zhuǎn)移到電子密度高的堿基上，發(fā)生烷化反應(yīng)，置換出氫原子，進(jìn)而改變氫鍵的能力，使DNA結(jié)構(gòu)改變。其誘導(dǎo)表現(xiàn)為嘌呤和嘧啶的轉(zhuǎn)換，DNA的N-7位置的H離子被活性烷基取代后，成為一個(gè)帶正電荷的集團(tuán)，易發(fā)生轉(zhuǎn)變型突變和置換型突變兩種遺傳效應(yīng)。EMS誘變?cè)硪妶D1。

圖1 EMS誘變?cè)?/p>

1.1 轉(zhuǎn)變型突變

烷化了的鳥嘌呤（G）不再與胞嘧啶（C）配對(duì)，從而造成G≡C堿基對(duì)變成T=A堿基對(duì)，EMS誘變大部分表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換型突變。

1.2 置換型突變

活化的鳥嘌呤（G）由于糖苷鍵發(fā)生斷裂，造成了脫嘌呤，而原來鳥嘌呤的位置成了一個(gè)空位，當(dāng)DNA分子在下一步復(fù)制的時(shí)候，4種堿基都有可能進(jìn)入到其互補(bǔ)位置，造成突變，但是這種現(xiàn)象的可能性較小。

2 EMS誘變的關(guān)鍵技術(shù)

EMS具有操作比較簡(jiǎn)單、突變頻率較高、突變專一及多效等優(yōu)點(diǎn)，其誘變成敗的關(guān)鍵技術(shù)如下。

2.1 適當(dāng)?shù)恼T變劑量

處理材料時(shí)，用適當(dāng)?shù)腅MS劑量以便于產(chǎn)生較多的變異，減少植株的不必要損傷。誘變過程中對(duì)材料造成半致死效應(yīng)的劑量通常作為誘變的最適劑量，或者設(shè)置誘變劑的濃度梯度及時(shí)間梯度來篩選最適誘變劑量。

2.2 適當(dāng)?shù)暮Y選

表型篩選鑒定、生物技術(shù)、生理生化檢測(cè)、遺傳學(xué)分析等方法篩選出產(chǎn)生的突變體。

2.3 突變性狀的遺傳分析及基因定位

根據(jù)突變后代F2、F3表現(xiàn)性狀，分析為主效基因或者是微效基因，然后采用兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)或者三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)的方法進(jìn)行基因定位。微效基因定位一般采用標(biāo)記分析、區(qū)間作圖以及復(fù)雜區(qū)間作圖等。

3 EMS誘變技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

3.1 EMS對(duì)水稻成熟胚的愈傷組織的誘導(dǎo)

在一定范圍內(nèi)，隨著誘變劑量或者濃度增加，誘變頻率也會(huì)隨之增加，如果超過一定的劑量范圍，植株死亡和細(xì)胞受損就會(huì)極大增加，因而被篩選掉的有利變異也會(huì)增加，進(jìn)而使育種效率降低。

樸鐵夫、原亞萍[2]等在離體培養(yǎng)條件下，EMS處理水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，觀察處理后愈傷組織的生長(zhǎng)變化、細(xì)胞染色體畸變和株體的分化情況。設(shè)定EMS的濃度梯度且每個(gè)梯度設(shè)置5次重復(fù)后取平均值。結(jié)果顯示，低濃度EMS處理水稻成熟胚的愈傷組織有刺激生長(zhǎng)的作用，而高濃度EMS處理對(duì)水稻成熟胚愈傷組織生長(zhǎng)則有抑制作用，這種抑制作用隨著EMS濃度的增高而加強(qiáng)；伴隨著EMS濃度的增高，愈傷組織細(xì)胞染色體具有微核細(xì)胞數(shù)明顯增加；從愈傷組織分化出來幼苗的情況看，低濃度EMS處理的愈傷組織分化出來的綠苗明顯比對(duì)照多，分化率較高，高濃度的EMS處理分化出來的綠苗明顯比對(duì)照少。其中最高濃度EMS處理的分化率最低。此試驗(yàn)表明，低濃度的EMS處理對(duì)水稻成熟胚愈傷組織的生長(zhǎng)和分化有促進(jìn)作用，而高濃度的EMS有抑制作用。低濃度的EMS對(duì)細(xì)胞呼吸強(qiáng)度及細(xì)胞色素氧化酶活性有刺激作用，高濃度EMS則表現(xiàn)為抑制作用。

劉丕慶[3]從水稻品種中丹二號(hào)的花藥和幼穗中分別誘導(dǎo)出二倍體、四倍體的愈傷組織，并利用EMS處理愈傷組織，調(diào)查處理的愈傷組織耐鹽細(xì)胞頻率的變化試說明耐鹽變異體篩選過程中使用誘變劑的重要。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過培養(yǎng)基配制、誘變處理、愈傷組織的篩選、相對(duì)生長(zhǎng)量、耐鹽細(xì)胞頻率和細(xì)胞的計(jì)算等方法，測(cè)定EMS對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用和EMS處理后愈傷組織耐鹽細(xì)胞頻率的變化。EMS在較低濃度下，愈傷組織生長(zhǎng)和對(duì)照相差比較少。EMS濃度達(dá)到一定濃度，愈傷組織生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，有些愈傷組織變褐死亡且相對(duì)生長(zhǎng)量約是對(duì)照的40%。當(dāng)EMS濃度達(dá)到一定量時(shí)，直到接種約20 d才有愈傷塊，很多愈傷塊已死亡。當(dāng)EMS濃度達(dá)到最大時(shí)，所有的愈傷塊都死亡。而經(jīng)EMS處理后的愈傷組織的耐鹽細(xì)胞頻率表沒有顯著高于或低于對(duì)照。此實(shí)驗(yàn)說明EMS誘導(dǎo)水稻愈傷組織，可以刺激或者抑制水稻愈傷組織的生長(zhǎng)，但是對(duì)愈傷組織耐鹽細(xì)胞頻率的變化幾乎沒有影響。

張小玲、王元輝[4]采用EMS處理水稻體細(xì)胞愈傷組織，誘導(dǎo)其產(chǎn)生變異。采用浸漬法及滴加法處理水稻體細(xì)胞愈傷組織，確定半致死質(zhì)量濃度。經(jīng)過與對(duì)照比較，確定再生植株株系的圖變頻率。試驗(yàn)配制3種培養(yǎng)基（誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化再生植株培養(yǎng)基），誘導(dǎo)愈傷組織，EMS處理，最后將再生植株D1代移栽到溫室，成熟后單株收貨構(gòu)成D2代，D2代田間種植，以原品種為對(duì)照，生育期間觀察記錄變異情況。結(jié)果顯示浸漬法處理水稻愈傷組織，EMS對(duì)水稻愈傷組織的半致死量為1～5 g/L；滴加法處理，水稻愈傷組織的半致死量為50 g/L。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，浸漬法的有點(diǎn)是愈傷組織各部分能與EMS充分作用，愈傷組織吸收EMS比較均勻，但是在浸漬和清洗過程中愈傷組織表面分生能力強(qiáng)的細(xì)胞容易脫落，提高愈傷組織的死亡率；而滴加法的優(yōu)點(diǎn)是愈傷組織經(jīng)過一段時(shí)間的恢復(fù)生長(zhǎng)后，進(jìn)一步處理時(shí)的存活率比較高，其缺點(diǎn)是愈傷組織與EMS作用不均勻，EMS長(zhǎng)期留在培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生一些分解物質(zhì)，對(duì)愈傷組織和綠苗有毒害作用。

試驗(yàn)上看，高濃度的處理得不到再生植株。另外，從有關(guān)EMS處理的報(bào)道中獲悉，EMS處理并不是濃度越高變異頻率就越高，較低的EMS濃度反而有較高的變異頻率。

3.2 EMS對(duì)水稻種子的誘導(dǎo)

EMS對(duì)水稻種子胚的誘變傷害稍輕，不像物理誘變的抑制或損傷效果那么強(qiáng)烈，物理誘變?nèi)珉婋x輻射，其穿透力較強(qiáng)且容易被染色體組吸收，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的破壞性很大，強(qiáng)烈抑制水稻種子的萌發(fā)和根、芽的生長(zhǎng)。

李學(xué)寶、楊學(xué)榮[5]等通過研究EMS對(duì)水稻萌發(fā)種子呼吸強(qiáng)度及多種酶活性影響，分析呼吸代謝、種子發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)高度和根系活力等之間的關(guān)系。選取飽滿的水稻品種秈稻“廣陸矮4號(hào)”預(yù)浸泡后用不同濃度的EMS震蕩處理。用TTC法、微量檢壓法、3，5-二硝基水楊酸比色法及愈創(chuàng)木酚法等對(duì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、呼吸強(qiáng)度、細(xì)胞色素氧化酶活性以及α-淀粉酶活性等進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示EMS對(duì)水稻種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)高度等的影響隨處理濃度的高低而異。低濃度的EMS提高幼苗的根系活力，根尖還原TTC的量明顯高于對(duì)照組；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加時(shí)，根系活力受到抑制并下降，最高濃度處理的TTCH含量達(dá)不到對(duì)照組的60%。較高濃度EMS的處理，根生長(zhǎng)速度降低并且根長(zhǎng)和根數(shù)明顯少于對(duì)照組。EMS對(duì)水稻萌發(fā)種子呼吸的影響、α-淀粉酶活性的影響均存在某一“臨界劑量”，在該劑量之下表現(xiàn)為促進(jìn)作用；超過此劑量后，變?yōu)橐种谱饔?，EMS作用的變化符合誘變劑作用的“劑量曲線”。但是EMS對(duì)氧化物酶活性的影響比較特殊：低濃度的EMS對(duì)過氧化物酶活性的影響不大；高于此劑量時(shí)，則該酶活性下降。該研究不僅研究了水稻種子萌發(fā)生長(zhǎng)初期形態(tài)學(xué)上的效應(yīng)，還對(duì)植物體內(nèi)發(fā)生的生理生化變化進(jìn)行了研究，為水稻EMS誘變育種提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

陳燦，徐慶國(guó)[6]等采用不同種類的化學(xué)誘變劑（EMS、NaN3和MNU）處理水稻種子，研究其萌發(fā)和生長(zhǎng)狀況。測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率：稻種的胚根長(zhǎng)度以與種子長(zhǎng)度相等為標(biāo)準(zhǔn)，胚芽長(zhǎng)度約以種子長(zhǎng)的1/2為標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算發(fā)芽率的同時(shí)還要測(cè)量水稻的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt（GT為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗長(zhǎng)度

誘變處理的水稻種子萌發(fā)對(duì)3種不同的化學(xué)誘變劑刺激的反應(yīng)基本相同，部分低劑量的誘變劑對(duì)水稻種子發(fā)芽刺激作用，但總的情況是隨著3種誘變劑濃度的增加，稻種的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率呈明顯下降的趨勢(shì)。低濃度的化學(xué)誘變劑對(duì)稻種發(fā)芽影響表現(xiàn)不大，高濃度的化學(xué)誘變劑如EMS和NaN3處理嚴(yán)重降低稻種的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

3.3 EMS對(duì)水稻幼穗的誘導(dǎo)

李學(xué)寶[7]用不同的EMS處理水稻離體幼穗，測(cè)定培養(yǎng)初期的呼吸強(qiáng)度、細(xì)胞色素氧化酶和同工酶及蘋果酸脫氫酶同工酶。采取幼穗，用含不同濃度EMS的液體培養(yǎng)基振蕩處理后將幼穗切成段，接種在固體培養(yǎng)基上。

低劑量的EMS對(duì)誘導(dǎo)率和分化率有一定的促進(jìn)作用；隨著EMS劑量逐漸加大，幼穗體細(xì)胞愈傷組織的誘導(dǎo)與分化均受到抑制，誘導(dǎo)效率和分化效率都表現(xiàn)明顯降低，處理組和對(duì)照組間差異顯著；高濃度的EMS延長(zhǎng)幼穗體細(xì)胞愈傷組織的產(chǎn)生，未處理和低濃度處理的幼穗培養(yǎng)到8～10 d，即可見有愈傷組織產(chǎn)生，高濃度處理需13～15 d才能看見有愈傷組織產(chǎn)生，比對(duì)照延遲了5～7 d，且愈傷組織生長(zhǎng)緩慢。低濃度的EMS對(duì)幼穗呼吸有一定促進(jìn)作用，在EMS較高濃度時(shí)，呼吸強(qiáng)度與EMS濃度呈負(fù)相關(guān)；EMS對(duì)培養(yǎng)幼穗具有持續(xù)的生理效應(yīng)；EMS對(duì)細(xì)胞色素氧化酶和對(duì)蘋果酸脫氫酶同工酶的影響與EMS對(duì)愈傷組織的影響相同。

3.4 EMS對(duì)水稻的其他誘導(dǎo)

EMS誘導(dǎo)水稻不單單表現(xiàn)在愈傷組織、種子、幼穗等，EMS對(duì)水稻右邊育種還有其他的應(yīng)用。

顧佳清、張智奇[8]等用化學(xué)誘變劑EMS對(duì)粳稻進(jìn)行誘變處理，來構(gòu)建突變體庫。結(jié)果顯示出0.5%濃度的EMS溶液處理水稻種子，再經(jīng)過0.5%和0.7%EMS溶液復(fù)合處理，發(fā)生突變的頻率12.4%，復(fù)合處理優(yōu)于一次性處理的效果。EMS誘變產(chǎn)生的突變體后代分離的基因數(shù)量較少且穩(wěn)定性比較好，不同株系產(chǎn)生的突變類型比較豐富。

陳忠明、王秀娥[9]等利用EMS對(duì)秈型水稻進(jìn)行誘變處理，以構(gòu)建基因突變?nèi)后w。M1代單本移栽并單株收取。M2代播種了5 000個(gè)家系，根據(jù)各個(gè)生育期的表現(xiàn)，鑒別篩選出了發(fā)生突變的411個(gè)家系，且收獲271個(gè)家系。M3代對(duì)M2代收獲材料按照系譜法進(jìn)行跟蹤觀察。表明形態(tài)性狀的突變率是8.22%，一些突變體具有的優(yōu)良性狀，可能在以后的育種中得到充分利用。

4 EMS誘變?cè)谒居N中應(yīng)用的展望

EMS的突變頻率相對(duì)比較高、能誘發(fā)出各種有用的突變基，能夠在原有遺傳背景基本不變的情況下，分子水平上使植物體出現(xiàn)有用表現(xiàn)性狀的變異。EMS對(duì)水稻誘變產(chǎn)生的突變主要有：穗部形態(tài)突變、籽粒形態(tài)突變、莖稈形態(tài)突變、葉片形態(tài)突變、育性突變及熟期突變等。在植物種質(zhì)資源創(chuàng)造、功能基因組學(xué)研究等方面發(fā)揮了重要作用。EMS在水稻育種中應(yīng)用的研究廣泛，在誘導(dǎo)水稻成熟胚的愈傷組織中，確定EMS的最適誘變濃度和最大突變率；誘導(dǎo)水稻種子，研究EMS對(duì)水稻種子一些生理生化指標(biāo)的變化；EMS誘導(dǎo)水稻幼穗，分析水稻呼吸強(qiáng)度、細(xì)胞色素氧化酶及蘋果酸脫氫酶同工酶等指標(biāo)的變化。此外，利用EMS誘變處理水稻，構(gòu)建基因突變?nèi)后w，試圖得到新的基因類型，對(duì)新型水稻育種途徑提供理論依據(jù)。但由于EMS本身有毒性、對(duì)誘變材料有損傷、突變的隨機(jī)性大等特點(diǎn)，導(dǎo)致要求誘變?nèi)后w的數(shù)量大，后期檢測(cè)工作量多。所以，有必要加強(qiáng)EMS誘變的深度研究，來控制變異的方向和性質(zhì)，進(jìn)一步加強(qiáng)高通量突變篩選技術(shù)的研究，提高誘變效率。

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（責(zé)任編輯：趙中正）