液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留

蔣翠紅

摘 要 目的：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水產(chǎn)品中的硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留情況。方法：使用乙酸乙酯液相色譜分離技術(shù)提取殘留在水產(chǎn)品中的藥物含量，并進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法的檢測(cè)活動(dòng)。結(jié)果：硝基呋喃類(lèi)藥物在水產(chǎn)品中的含量保持在1～50 ng/ mL范圍之內(nèi)，比標(biāo)準(zhǔn)的范圍值低10.4%。結(jié)論：這種方法具有準(zhǔn)確性、靈敏性、專(zhuān)屬性，對(duì)分析水產(chǎn)品中含硝基呋喃類(lèi)藥物含量非常的有效。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；硝基呋喃類(lèi)藥物；水產(chǎn)品

中圖分類(lèi)號(hào)：TS254.7；O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2016）06--02

硝基呋喃類(lèi)藥物是一種綜合型的光譜抗生素，具有預(yù)防畜禽胃腸道疾病的發(fā)生作用，經(jīng)常用作飼料添加劑。這種藥物帶有慢性毒性，長(zhǎng)期使用對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生一定的毒素，引起癌變、畸形等。這種藥物在動(dòng)物體內(nèi)半衰期短，代謝速度快，可以長(zhǎng)時(shí)間的殘留與代謝，并伴有毒性，因此，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，是為了更好地監(jiān)控其在水產(chǎn)品中的殘留情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，震蕩器、離心機(jī)、氮吹儀。乙腈，甲醇，乙酸乙酯，正己烷均為色譜純；50 mmol/L 2-硝基苯甲醛；0.125 mol/L鹽酸溶液；1 mol/L氫氧化鉀溶液；1 mol/L磷酸氫二鉀溶液。硝基呋喃及同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg的AOZ、SEM、AHD、AMOZ、AMOZ-D5、AOZ-D4、AHD-D3、SEM-13C15標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98.0%），用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，各組分濃度均為100 ?g/mL。

1.2 樣品前處理

提取粉碎魚(yú)肉2.00 g放在50 mL的離心管里，并加入150 ?g的內(nèi)標(biāo)混合工作液，加入適量的鹽酸溶液均勻的搖晃30 s，再使用5 mL的0.125 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行洗滌勻漿刀，與鹽酸溶液一起放入離心管里。再加入2-肖基苯甲醛，搖晃半分鐘后放于搖床中進(jìn)行反應(yīng)。將離心管中的上清液倒入另一個(gè)離心管中進(jìn)入調(diào)試環(huán)節(jié)，保持pH數(shù)值在7～7.5。加入7 mL的乙酸乙酯進(jìn)行分離，并要重復(fù)上述步驟，最后使用氮吹儀進(jìn)行吹干處理，使用乙腈和乙酸水溶液對(duì)殘?jiān)M(jìn)行溶解，并加入正己烷進(jìn)行脫脂，將得到的下層溶液在12 000 r/min下進(jìn)行離心10 min后，經(jīng)過(guò)0.2 ?m濾膜的過(guò)濾，最后使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定[1]。

1.3 液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

首先是液相色譜的條件：色譜柱100 mm×2.0 mm，粒度5 ?m，流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 ?L。流動(dòng)相梯度洗脫見(jiàn)表1所示。其次是質(zhì)譜條件：使用ESI的接口方式，霧化器6 mL/min，氣簾氣8 mL/min，加熱溫度450 ℃，碰撞氣5 mL/min，使用5 000 V的電離電壓，采用多反應(yīng)選擇離子的監(jiān)測(cè)方法作為掃描方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

硝基呋喃類(lèi)藥物的特點(diǎn)是代謝速度很快，與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，呈現(xiàn)出結(jié)合狀態(tài)的模式依附于動(dòng)物的體中，當(dāng)遇到適合的酸度條件時(shí)，會(huì)產(chǎn)生釋放作用，代謝物的特點(diǎn)是小的分子化合物，分子的數(shù)值要保持在75～201，很難在質(zhì)譜儀中產(chǎn)生特性的離子碎片，定性定量也非常的困難。本次試驗(yàn)使用的是衍生化試劑的柱前衍生方法，同時(shí)進(jìn)行酸水解與衍生化。當(dāng)衍生環(huán)節(jié)完成以后，會(huì)加大了代謝物的分子的質(zhì)量，一般在208～335范圍內(nèi)，在合理的電壓作用下，可以產(chǎn)生2個(gè)以上的特征性離子碎片峰。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

開(kāi)啟ESI模式進(jìn)行電離子活動(dòng)，使用Q1開(kāi)始掃描來(lái)確定每一組分母離子與子離子，將自動(dòng)與手動(dòng)結(jié)合在一起對(duì)代謝物進(jìn)行離子化合物的分離與優(yōu)化，并要對(duì)各種成分進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)活動(dòng)，包括靈敏度，如果靈敏度不相同，那么得到的離子源條件會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的偏重問(wèn)題。

2.3 pH值對(duì)硝基呋喃代謝物提取效率的影響

如表2所示，是樣品提取液pH數(shù)值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響表。通過(guò)這些數(shù)據(jù)可以分析出，4種代謝物的提取效率都受到pH數(shù)值的影響，直接決定了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且嚴(yán)重的影響了每一組的保留時(shí)間，因此，采用這種方法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)pH數(shù)值有非常高的要求，在進(jìn)行提取液pH數(shù)值的調(diào)試過(guò)程中，要在間隔半分鐘以后重新測(cè)定，保證pH數(shù)值在7～7.5的范圍中。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)及檢出限

參照樣品前處理?xiàng)l件，按照色譜與質(zhì)譜的測(cè)度條件對(duì)AOZ、SEM、AHD、AMOZ的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液進(jìn)行測(cè)定，如圖1所示，是對(duì)硝基呋喃代謝物的快速檢測(cè)圖樣。表4表示的是回歸方程、相關(guān)系數(shù)。依據(jù)儀器信噪比提供的數(shù)據(jù)，并參考了有關(guān)硝基呋喃代謝物檢測(cè)的數(shù)據(jù)資料，得出這種方法的檢出限是0.5 ?g/kg。

圖1 硝基呋喃代謝物的快速檢測(cè)

2.5 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

在不含有硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留物質(zhì)的烤鰻身上進(jìn)行添加抗生素藥物的回收與精密度的試驗(yàn)，按照使用的方法分別加入了0.5、0.75、1.0 ?g/kg的抗生素溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)提供的數(shù)據(jù)可以有效的分析出4種代謝物質(zhì)回收率的平均數(shù)值在88.8%～111.0%，小于或等于標(biāo)準(zhǔn)偏差的15%。

2.6 試驗(yàn)中應(yīng)注意問(wèn)題

在進(jìn)行硝基呋喃類(lèi)代謝物在水產(chǎn)品中殘留的試驗(yàn)時(shí)，要注意，硝基呋喃類(lèi)代謝物在光合作用下，會(huì)進(jìn)行分解反應(yīng)，因此，在進(jìn)行試驗(yàn)的過(guò)程中，要注意避光。此外，試驗(yàn)使用的樣品不同，得到的試驗(yàn)結(jié)果也不相同，例如：使用面包蝦與蝦仁進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，得到的SEM結(jié)果是不同的。試驗(yàn)使用的儀器設(shè)備、環(huán)境都會(huì)對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果帶來(lái)一定的影響，干擾檢測(cè)的結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

本文使用柱前衍生的方法，檢測(cè)出4種硝基呋喃類(lèi)代謝物都是具有非常好的質(zhì)譜特征的化合物，增加了檢測(cè)物質(zhì)的定性與定量。使用同位素內(nèi)標(biāo)檢測(cè)、定量、測(cè)試的方法，是為了更好地提升試驗(yàn)使用方法的回收率與精密度，根據(jù)三離子確證的原則，增強(qiáng)了使用方法的可靠性，保障了試驗(yàn)樣品技術(shù)的正確性。

參考文獻(xiàn)

[1]王璟，楊楠，趙晶，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008（6）：978-980.

（責(zé)任編輯：劉昀）