火龍果花中多酚類化合物抗氧化活性研究

李國勝 張偉敏

摘 要 對(duì)火龍果花中多酚類化合物抗氧化活性進(jìn)行研究。采用抗氧化能力的體外實(shí)驗(yàn)方法，研究火龍果花中多酚類化合物的還原能力、清除·OH、O2-、 DPPH·和ABTS·四種自由基的能力，以評(píng)價(jià)其抗氧化性，并以BHT作為陽性對(duì)照。結(jié)果表明，火龍果花中多酚類化合物抗氧化能力與濃度（0.4～0.8 mg/mL）呈量效關(guān)系。雖總體抗氧化活性較弱于BHT，但總體趨勢(shì)與BHT相同，在濃度為0.7 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除活性甚至略高于對(duì)比溶液。因此，火龍果花中多酚類化合物具有較好的抗氧化活性，可進(jìn)一步研究開發(fā)為抗氧化功能性食品。

關(guān)鍵詞 火龍果花 ；多酚類化合物 ；抗氧化活性 ；自由基 ；還原能力

分類號(hào) S667.9 ；R96 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.002

Antioxidant Activity of Pitaya Flower Polyphenol Compounds

LI Guosheng ZHANG Weimin

（College of Food Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract The pitaya flower polyphenol compounds in antioxidant activity were studied. Using antioxidant activity in vitro methods， research the pitaya flower polyphenol compounds in reducing power， scavenging·OH， O2-， DPPH， ABTS· four kinds of free radical ability to evaluate its antioxidant and BHT as the positive control.The results showed that pitaya flower polyphenol compounds in antioxidant capacity and concentration （0.4～08 mg/mL） assumes the concentration-response relationship. Although the overall antioxidant activity is less than BHT， but the overall trend is the same as BHT， at the concentration is 0.7 mg/mL， the scavenging hydroxyl radical scavenging activity and even slightly higher than the contrast solution. Therefore， pitaya flower polyphenol compounds has good antioxidant activity， could be further studied and developed for antioxidant functional food.

Keywords pitaya flower ； polyphenols ； antioxidant activity ； free radicals ； reducing power

火龍果（pitaya）又稱紅龍果、仙蜜果、情人果等，為仙人掌科量天尺屬（Hylocereus）或蛇鞭柱屬（Selenicereus）的果用栽培品種[1]，原產(chǎn)哥斯達(dá)黎加、尼加拉瓜、墨西哥、 古巴等中美洲沙漠地區(qū)，目前我國臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、福建、貴州等地有廣泛栽培?；瘕埞ǘ渚薮蠊鉂?，營養(yǎng)豐富，藥用成分廣泛，其營養(yǎng)成分包含人體必需的氨基酸、維生素、膳食纖維、蛋白質(zhì)等，藥用成分主要為多酚、黃酮、三萜類化合物等活性物質(zhì)，具有抑菌抗癌、清熱解毒、降低三高等功效[2]。作為一種新食品資源，備受消費(fèi)者的青睞，同時(shí)也受到國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。近年來對(duì)其開展的研究較為活躍。已報(bào)道的文獻(xiàn)有火龍果花營養(yǎng)成分分析、火龍果花的干制[3]、火龍果花保健飲料制作[4]等。夏杏洲等[5]建立了熱風(fēng)干燥和微波干燥干制火龍果花的工藝條件：用 100℃水蒸氣處理0.5 min；采用變溫干燥方法：60℃，0.5 h→70℃，1.0 h→55℃，0～2.0 h或者微波干燥方式：裝載量0.25 kg，微波強(qiáng)度700 W，時(shí)間11.6 min，可以獲得復(fù)水性好、營養(yǎng)成分保存率高、品質(zhì)優(yōu)良的火龍果花干品。

多酚類化合物的主要功能性質(zhì)是作為許多酶體系的抑制劑或激活劑、金屬螯合劑以及自由基清除劑[6]。多酚類化合物通過酚羥基的離解和自由基途徑產(chǎn)生抗氧化作用，是醫(yī)藥、食品、化妝品中很有前景的一類天然抗氧化劑和自由基清除劑?，F(xiàn)有許多測(cè)試抗氧化活性的方法，如DPPH檢測(cè)法，ABTS檢測(cè)法，超氧陰離子檢測(cè)法等。DPPH檢測(cè)法的根據(jù)為DPPH自由基于517 nm處有一強(qiáng)吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，通過使DPPH分子中1個(gè)穩(wěn)定自由基與抗氧化劑提供的1個(gè)電子配對(duì)結(jié)合使DPPH的特征紫色消失，褪色的程度和自由基清除劑的電子數(shù)量存在定量關(guān)系，因此，可用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析[7]；而ABTS自由基既是親水型化合物又是親脂型化合物，所以較DPPH自由基更容易反應(yīng)，ABTS·的清除是電子轉(zhuǎn)移過程，體系中的抗氧化劑與其反應(yīng)將會(huì)使溶液褪色，表現(xiàn)為吸光值的降低[8]。測(cè)定超氧陰離子自由基清除活性常用鄰苯三酚自氧化法[9]。本實(shí)驗(yàn)以火龍果花為原料，采用5種體外抗氧化評(píng)價(jià)方法測(cè)定多酚類化合物的抗氧化性能，以期為火龍果花中多酚類化合物的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果花，市售袋裝干貨制品，于50℃下烘干，中藥粉碎機(jī)粉碎后，過50目篩，放入干燥器中備用。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)）、YHG型遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、722紫外可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司生產(chǎn)）、GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、AL204電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)]、中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）、索氏抽提裝置。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品[Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司生產(chǎn)]、乙醇（95%）（AR）（廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）、無水碳酸鈉（AR）（天津市諾克科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）、福林酚（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)）、石油醚（沸程30～60℃）（AR）（天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）；無水乙醇、Tris、無水氯化鋁、BHT、抗壞血酸、DPPH、綠礬、水楊酸、ABTS、雙氧水、鄰苯三酚、K2S2O8、檸檬酸、氯化亞鐵、濃鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸均為市售分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

為去除脂溶性色素等干擾，將火龍果花干品用石油醚在50℃下索氏抽提4 h，揮干溶劑，放入干燥器中備用。

稱取1.0 g處理后的火龍果花干品置于250 mL圓底燒瓶中，加入40 mL 50%的乙醇溶液，50℃條件下加熱回流提取40 min后，將提取液3 000 r/min離心5 min，取上清液，定容至50 mL備用。

1.2.2 總多酚含量測(cè)定

1.2.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用福林酚法[10]：將0.002 5 g沒食子酸溶于蒸餾水并定容至250 mL。分別移取1、2、3、4、5、6 mL沒食子酸溶液于10 mL容量瓶中。上述溶液可以分別表示沒食子酸濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合，在3～4 min內(nèi)，加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，混合后定容。將上述溶液在室溫下避光放置100 min后，于760 nm波長下測(cè)定吸光值A(chǔ)。同時(shí)做空白對(duì)照。以沒食子酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。

測(cè)得其回歸方程為y=9.251 4 x+0.056 5。

1.2.2.2 總多酚測(cè)定

根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算火龍果花干中總多酚的含量（以沒食子酸計(jì)）。

總多酚含量（以沒食子酸計(jì)，m/g）=（A1×V1）/W。

其中：A1為提取液中多酚的濃度（mg/mL）；V1為提取液總體積（mL），W為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 火龍果花中多酚類化合物抗氧化活性研究

1.2.3.1 對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定[11]

DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用無水乙醇溶解5.947 mg DPPH并定容于50 mL的棕色容量瓶中，得濃度為118.94 mg/L DPPH貯備液，搖勻并避光保存以備用。

取7支10 mL容量瓶，編號(hào)，各加入2.0 mL不同濃度樣品溶液，分別加入2.0 mL濃度為118.94 mg/L的DPPH溶液，搖勻后反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度A1。以2.0 mL無水乙醇代替DPPH的吸光度為A2，以2.0 mL的去離子水代替樣品溶液的吸光度為A0，以BHT作為陽性對(duì)照。清除DPPH·自由基活力公式為：

清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%

其中，樣品溶液吸光度為A1；以無水乙醇代替DPPH的吸光度為A2；以去離子水代替樣品溶液的吸光度為A0。

1.2.3.2 對(duì)羥自由基清除活性的測(cè)定[12]

10 mmol/L FeSO4溶液的配制：用去離子水溶解綠礬0.139 g，定容于50 mL容量瓶中。

5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液的配制：稱取0.069 g水楊酸，用乙醇溶解，并用去離子水定容于100 mL容量瓶。

取7支具塞試管，分別加入10 mmol/L FeSO4 1.0 mL和5 mol/L水楊酸-乙醇溶劑2.0 mL，混勻，再分別加入各濃度的樣品溶液1.0 mL，之后再加入0.1%的H2O2溶液1.0 mL，去離子水定容至10 mL，在37℃水浴中恒溫反應(yīng)30 min后，于波長510 nm處測(cè)定其吸光度值為A1，以去離子水代替試樣的吸光度為A2，以去離子水代替試樣及H2O2的吸光度為A0，以消除樣品本身影響，以BHT作為對(duì)照。清除羥自由基活力公式為：

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%

其中，樣品吸光度值為A1；以去離子水代替試樣的吸光度為A2；以去離子水代替試樣及H2O2的吸光度為A0。

1.2.3.3 對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定[13]

用去離子水將ABTS配制成7 mmol/L儲(chǔ)備液，加入K2S2O8固體， 使儲(chǔ)備液中K2S2O8濃度達(dá)到2.45 mmol/L，于室溫避光放置2 d備用；用 0.01 mol/L的 PBS（pH7.4）稀釋，使其在732 nm下測(cè)得吸光度在（0.700±0.050）范圍內(nèi)；將0.05 mL不同濃度的樣品溶液，混合1.9 mL ABTS溶液，在室溫下放置3 min后測(cè)其吸光度，BHT做陽性對(duì)照。

清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100%

其中，A0為不加樣液的ABTS溶液的吸光度；A1為加入樣品溶液的吸光度。

1.2.3.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定[14]

10 mmol/L鹽酸溶液的配制：用移液管精確吸取0.09 mL濃鹽酸，用去離子水稀釋并定容于100 mL容量瓶中即得。

25 mmol/L鄰苯三酚溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.157 6 g鄰苯三酚粉末，用已經(jīng)配制好的10 mmol/L鹽酸溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中即得。

0.1 mol/L Tris溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.302 8 g Tris粉末，用去離子水溶解并定容于25 mL容量瓶中即得。

pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制：量取已配制的0.1 mol/L Tris溶液25 mL和已配制好的0.1 mol/L鹽酸溶液11.45 mL，混合，搖勻后用去離子水定容于50 mL容量瓶中，即得0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液。

取4 mL pH 8.2的50 mmo1/L Tris-HC1緩沖溶液，25℃水浴鍋中水浴20 min后取出，加入0.4 mL樣品溶液和0.4 mL 25℃預(yù)熱的25 mmo1/L鄰苯三酚溶液，在波長325 nm處測(cè)定吸光度A1，以0.4 mL去離子水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度為A0，以0.4 mL 10 mmol/L的鹽酸溶液代替25 mmo1/L鄰苯三酚溶液，測(cè)得吸光度為A2，以BHT作為對(duì)照。清除超氧陰離子自由基活力可用以下公式表示：

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%

其中，樣品吸光度為A1；以0.4 mL 10 mmol/L的鹽酸溶液代替25 mmo1/L鄰苯三酚溶液，測(cè)得吸光度為A2；以0.4 mL去離子水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度為A0。

1.2.3.5 還原能力的測(cè)定[15]

用移液管吸取1.00 mL樣品溶液置于25 mL具塞試管中，再加人pH 6. 6的磷酸鹽緩沖液2.50 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.50 mL，混勻。在50℃水浴中，放置20 min。然后向試管中加人10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混勻后以3 000 r/min離心10 min，最后分別量取2.50 mL混合液、蒸餾水和0.1%氯化鐵溶液于試管中，混勻，靜置10 min。在700 nm處測(cè)定吸光度為A1，以80%乙醇試劑代替試樣作為空白對(duì)照，其吸光度為A0，以BHT作為對(duì)照。

總還原能力為 A1-A0。

其中：樣品吸光度為A1，以80%乙醇試劑代替試樣作為空白對(duì)照，其吸光度為A0。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

由圖1可看出，樣品溶液自由基清除能力與其濃度成正比。濃度在0.4～0.6 mg/mL時(shí)，樣品溶液對(duì)DPPH自由基清除率與BHT不相上下，甚至在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，樣品溶液的清除率（74.24%）還略高于對(duì)比溶液（68.30%）。當(dāng)樣品溶液表現(xiàn)最強(qiáng)清除能力時(shí)，濃度為0.7 mg/mL，清除率達(dá)到78.45%，但較弱于陽性對(duì)照BHT（93.59%）。且在該濃度后，樣品溶液曲線呈下降趨勢(shì)，對(duì)比溶液仍緩慢上升。由于樣品溶液中多酚類化合物僅是粗提取產(chǎn)物，因此，其他雜質(zhì)可能會(huì)使溶液清除率受到影響。

2.2 對(duì)羥自由基清除活性的測(cè)定

采用改良的Smirnoff水楊酸法，即利用H2O2與 Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+ H2O+Fe3+，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在 510 nm處有最大吸收。由圖2可看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，火龍果花中多酚類化合物對(duì)羥自由基的清除率上升較快。BHT對(duì)羥自由基的清除率有緩慢的升高。當(dāng)濃度為0.6 mg/mL時(shí)，樣品溶液清除率與BHT趨近相同，且當(dāng)濃度為0.7 mg/mL時(shí)，樣品溶液清除率（69.98%）甚至略高于BHT（清除率為67.63%）。在實(shí)驗(yàn)過程中，因Fe2+有較強(qiáng)的還原性，能與許多氧化劑反應(yīng)，如氯氣，氧氣等，造成在配置FeSO4溶液過程中部分Fe2+會(huì)氧化成Fe3+，容易產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)表明，火龍果花中多酚類化合物對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3 對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

由圖3可看出，火龍果花中多酚類化合物對(duì)ABTS自由基清除率隨著濃度升高而緩慢上升。總體來看，清除作用不強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，樣品溶液表現(xiàn)最強(qiáng)清除率為48.77%，弱于陽性對(duì)照BHT（清除率為67.88%）。因樣品溶液濃度不純，可能影響其清除率的測(cè)定。而樣品溶液清除率曲線趨勢(shì)與BHT相仿，可以看出其對(duì)ABTS自由基也有較好的清除能力。

2.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定

結(jié)果如圖4所示，樣品溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率雖然有所升高，但趨勢(shì)較為緩慢，在濃度為0.4 mg/mL時(shí)，樣品溶液清除率僅為23.38%，而BHT清除率（58.76%）接近其3倍。在其表現(xiàn)最強(qiáng)清除能力，當(dāng)濃度為0.8 mg/mL 時(shí)，抑制率不到50%，而BHT清除率在濃度范圍內(nèi)一直維持在60%左右。因此，火龍果花對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，但是較弱。

2.5 還原能力的測(cè)定

本試驗(yàn)以普魯士藍(lán)的生成作為檢測(cè)指標(biāo)，待測(cè)樣品將Fe3+鐵氰化物還原為Fe2+鐵氰化物，反應(yīng)體系溶液變?yōu)椴煌潭鹊乃{(lán)色，其在700 nm處有特征光吸收，吸光度大小反應(yīng)待測(cè)樣品的抗氧化活性。由圖5可知，隨著樣品濃度的增加，吸光值逐漸升高，即鐵離子還原能力逐漸升高。在濃度0.7 mg/mL前，樣品溶液與BHT還原能力趨勢(shì)一致，在濃度為0.8 mg/mL時(shí)，樣品溶液趨勢(shì)已接近平緩，而BHT依舊呈上升趨勢(shì)?？赡苁嵌喾拥娜芙庑韵拗屏似浣饘衮夏芰Φ陌l(fā)揮，所以即使樣品溶液還原力與濃度存在量效關(guān)系，但還原能力一般，弱于陽性對(duì)照BHT。

3 結(jié)論與討論

本研究采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了火龍果花中多酚類化合物的還原能力、清除·OH、O2-、DPPH·和ABTS·四種自由基的能力以評(píng)價(jià)其抗氧化性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：火龍果花中的多酚類化合物能夠較好地清除DPPH自由基和羥自由基，且與對(duì)照試劑BHT清除率大致相同，甚至在個(gè)別濃度下可以超過對(duì)照溶液BHT。對(duì)ABTS自由基與超氧陰離子清除能力較弱，其還原能力一般，弱于陽性對(duì)照BHT?？傮w來看，火龍果花抗氧化能力與濃度呈量效關(guān)系，趨勢(shì)與BHT相同。所以火龍果花中多酚類化合物具有較好的抗氧化活性，可進(jìn)一步研究開發(fā)為抗氧化功能性食品。

研究者發(fā)現(xiàn)，用不同方法對(duì)同一物質(zhì)的抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果可能不一致、甚至是自相矛盾的，而且多酚類物質(zhì)具有酚羥基團(tuán)既可以成為氫供體又可作為電子供體，使得他們通常擁有不同的抗氧化潛力[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的福林酚法測(cè)定火龍果花多酚化合物的含量，分別采用DPPH法、水楊酸法、ABTS測(cè)定法、鄰苯三酚自氧化法和普魯士藍(lán)法測(cè)定其抗氧化能力，以期獲得全面、準(zhǔn)確的火龍果花多酚化合物抗氧化活性數(shù)據(jù)，為火龍果花深度開發(fā)利用提供一定的理論參考。

本研究樣品溶液均為火龍果花中多酚類化合物的粗提取物，摻雜許多雜質(zhì)，其中某種物質(zhì)可能抑制多酚類化合物的抗氧化活性，提取物樣品中一些非多酚抗氧化物質(zhì)的存在，也可能對(duì)其抗氧化活性起到協(xié)同作用，增強(qiáng)其抗氧化能力。如果提高提取物純度，是否會(huì)產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或影響。多酚物質(zhì)與其抗氧化活性之間的具體構(gòu)效關(guān)系，還需要進(jìn)一步對(duì)火龍果花多酚類化合物組分分離、結(jié)構(gòu)鑒定等基礎(chǔ)上進(jìn)行分析。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中，有些材料試劑會(huì)自發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本研究僅在濃度為0.4～0.8 mg/mL的范圍內(nèi)進(jìn)行了探討，并不能代表整個(gè)課題。如濃度在0.8 mg/mL以上時(shí)，樣品溶液對(duì)羥自由基的清除能力是否會(huì)超過BHT，對(duì)超氧陰離子的清除能力是否會(huì)越來越接近對(duì)比試劑等，希望這些問題能在后續(xù)的研究中進(jìn)一步分析探討。

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