神經型一氧化氮合酶在大菱鲆腦組織中的分布及定位

韓卓然 石洪玥 孫敬鋒 王一澤 邢克智

摘要：【目的】探明神經型一氧化氮合酶（nNOS）在大菱鲆（Scophthalmus maximus）腦組織中的分布情況，為揭示大菱鲆腦組織中一氧化氮（NO）的生理功能提供形態(tài)學資料?！痉椒ā糠謩e采用NADPH-d組織化學染色法和免疫組織化學法對大菱鲆腦組織中的nNOS進行定位研究?！窘Y果】NADPH-d組織化學染色結果顯示，大菱鲆大腦皮質中有藍色的神經元和神經纖維存在。神經元呈梭形、錐形等形狀，神經纖維呈串珠狀且無序交織；小腦中NOS陽性神經元在分子層分布稀疏，在顆粒層分布密集，浦肯野細胞胞核淡染。經免疫組織化學法染色后，可觀察到大腦皮質中nNOS免疫組化反應陽性物質呈深棕色；小腦皮質的分子層、顆粒層及浦肯野細胞層均有nNOS陽性神經元分布，浦肯野細胞呈免疫組織化學陽性反應?！窘Y論】大菱鲆腦組織中的NOS類型主要限于nNOS，且nNOS在神經活動中發(fā)揮重要作用，也進一步證實NO在不同物種中具有一些共同的作用，但不同物種或相同物種不同組織中NO分布及含量存在差異。

關鍵詞： 大菱鲆；神經型一氧化氮合酶（nNOS）；一氧化氮（NO）；腦組織；分布；免疫組織化學定位

中圖分類號： S965.399 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0296-05

0 引言

【研究意義】一氧化氮（NO）是一種效應分子和細胞信使分子，其結構簡單，具有反應性強、易擴散、性質活潑不穩(wěn)定、生物半衰期非常短等特點，廣泛存在于生物體內的各組織器官中，參與機體的多種生理及病理過程（鄔曉敏和金成，2005）。在NO生成過程中，一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOS）是必不可少的酶，根據其存在的細胞類型可分為3種亞型（梁潤梅，2003；馬倩倩等，2013）：第一種是神經型一氧化氮合成酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS），存在于神經元和神經纖維中，其主要生物效應是在細胞間傳遞信息，具有傳遞和調節(jié)介質的作用；第二種是誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要存在于巨噬細胞、小膠質細胞、血管平滑肌細胞和血管內皮細胞中，iNOS在正常生理條件下不表達，只有在脂多糖、細胞因子、細菌和病毒刺激下才被激活表達；第三種是內皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS），主要分布在血管內皮細胞中。因此，對大菱鲆（Scophthalmus maximus）腦組織NOS進行定位研究，可為揭示大菱鲆腦組織中NO的生理功能提供形態(tài)學資料?！厩叭搜芯窟M展】自Hope等（1991）提出神經元性依賴還原型輔酶Ⅱ黃遞酶（NADPH-d）即NOS后，國內外學者便開始采用NADPH-d組織化學染色法研究NOS在神經系統(tǒng)內的細胞定位。隨著對NOS分子生物學性質認識的不斷深入，發(fā)現NOS與NADPH-d尚存在許多本質性的差異，如分子量、氨基酸序列和酶活性結構域等，利用NADPH-d組織化學法也無法區(qū)分NOS的3種亞型。而免疫組織化學法是利用抗原與抗體結合的特性，能準確區(qū)分NOS的亞型。已有學者利用NADPH-d組織化學染色結合免疫組織化學方法證實，在高等動物中樞神經系統(tǒng)中存在nNOS，由nNOS催化產生的NO在神經系統(tǒng)的信息傳導和生理活動中發(fā)揮調節(jié)作用（梁閏梅，2003；Singru et al.，2003，2007；Salchner et al.，2004；Yu et al.，2013）。但在現有的相關研究中，其對象主要是人類及鼠、兔、豬等哺乳動物，研究重點也多集中于患病、應激等特殊情況下nNOS的表達及其表達對機體生理機能的影響（Mishra et al.，2006；Rao et al.，2011；Ling et al.，2012；張朝再等，2014；Zou et al.，2015），僅有少數針對魚類nNOS定位研究的報道，如馬倩倩等（2013）、Biswas等（2015）分別對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）、鯉魚（Cyprinus carpio）腦組織中nNOS進行免疫組織化學定位。【本研究切入點】nNOS在腦組織中參與了化學信號感受、運動、內臟活動、神經調節(jié)等復雜的生理過程（Aley et al.，1998；王曉安等，2007），且不同種類動物nNOS的分布及表達量差異顯著，但此類研究在魚類中開展得相對較少?！緮M解決的關鍵問題】運用NADPH-d組織化學染色和免疫組織化學兩種方法對大菱鲆腦組織nNOS的分布及定位進行研究，揭示大菱鲆腦組織中NO的生理功能，也為不同魚類nNOS研究提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用大菱鲆購自天津市西青區(qū)王頂堤水產品批發(fā)市場，健康無病，體長32.1 cm，體重550.0 g。β-NADPH、NBT、三卡因購自美國Sigma公司；MS-222、Triton X-100、L-多聚賴氨酸、蘇木素染劑購自北京鼎國生物技術有限公司；一抗（兔抗小鼠nNOS）、二抗（山羊抗兔IgG）購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根酶標記鏈親和素、DAB/H2O2染色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1. 2 樣品采集及處理

將大菱鲆用MS-222進行麻醉，然后用100 mL生理鹽水快速沖洗魚體表面。在冰盤上取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定5 h，然后移入20%蔗糖磷酸緩沖液中浸泡至組織沉底，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 NADPH-d組織化學染色

冷凍切片（厚度為15 μm）用PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；于37 ℃下β-NADPH孵育液（0.3% Triton X-100、1 mg/mL NBT、0.6 mg/mL β-NADPH、0.1 mol/L PBS）孵育3 h；然后將切片移入蒸餾水中15 min；常規(guī)脫水、透明、封片。

1. 4 免疫組織化學定位

切片在3%過氧化氫—甲醇溶液中37 ℃孵育30 min，以阻斷內源性酶活性；再經10%正常山羊血清恒溫（37 ℃）封閉10 min；切片滴加稀釋后的一抗（兔抗小鼠nNOS），置于4 ℃冰箱內孵育過夜，再用生物素標記山羊抗兔IgG孵育1 h；隨后將辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液滴加到各冰凍切片的組織上，37 ℃恒溫箱孵育30 min。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。經DAB/H2O2染色后用蘇木素復染，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照以PBS代替一抗。

2 結果與分析

2.1 NADPH-d組織化學染色結果

從NADPH-d組織化學染色的大菱鲆大腦組織中，可觀察到染成藍色的神經纖維相互無序交織（圖1-a），神經纖維部分呈串珠狀，神經元細胞核著色較淺，能清楚看到突觸（圖1-b）。藍色的神經元呈梭形或錐形等多種形狀，呈陽性反應的神經元胞漿可觀察到明顯的藍色顆粒物質（圖1-c）。小腦分子層中藍色神經元細胞分布稀疏（圖2-a），而顆粒層神經元細胞分布密集，呈顆粒狀，均染成藍色。浦肯野細胞胞核淡染，胞質被染為藍色，呈陽性（圖2-b）。

2. 2 免疫組織化學定位結果

經免疫組織化學染色，大菱鲆腦組織中的nNOS免疫組化反應陽性物質呈深棕色。在大腦皮質可觀察到nNOS免疫組化反應陽性神經元和神經纖維，均呈深棕色，神經纖維相互交織呈網狀（圖3）。小腦皮質的分子層、顆粒層及浦肯野細胞層均有nNOS陽性神經元分布（圖4-a），浦肯野細胞呈免疫組織化學陽性反應（圖4-b）。

3 討論

NO是一種特殊的神經信息物質，在信息傳遞、神經發(fā)育、介導興奮性毒性、調節(jié)神經再生等生理過程中發(fā)揮著不可替代的作用（鄔曉敏和金成，2005）。內源性NO是由L-精氨酸經過NOS催化作用而產生，形成了一個NO-NOS體系，因此NOS分布情況可揭示組織中NO的作用部位（Gourdon et al.，2001）。本研究結果表明，大菱鲆腦組織經NADPH-d組織化學染色后，可觀察到大量呈陽性反應的神經纖維和神經元。陳小囡等（2002）通過NADPH-d組織化學染色，發(fā)現NOS陽性神經元在鳙（Aristichthys nobilis）的小腦部分十分密集，神經元胞體體積較大，呈三角形、圓形或卵圓形。大菱鲆和鳙同為硬骨魚類，在親緣關系上距離較近，致使nNOS在兩種魚類腦部的分布情況十分相似。王曉安和蔣小滿（2005）對口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）進行NADPH-d組織化學染色，發(fā)現其腦神經節(jié)中并無NADPH-d陽性細胞胞體存在，但有少量來自腹神經鏈的陽性纖維進入腦神經節(jié)。雖然大菱鲆與口蝦蛄同為海生動物，但兩種生物的親緣關系較遠，故導致其神經系統(tǒng)NOS陽性細胞分布存在較大差異。

由于NADPH-d組織化學染色法無法直接區(qū)分NOS的3種亞型，為此本研究同時采用免疫組織化學法對nNOS進行定位，結果表明，大菱鲆大腦皮質及小腦皮質的分子層、顆粒層和浦肯野細胞層均存在nNOS，故推斷nNOS作為神經分子參與了神經調節(jié)過程。沈偉哉等（2002）以大鼠腦干為研究對象，應用免疫組織化學法進行定位，結果發(fā)現nNOS免疫組化陽性神經元呈棕褐色，細胞核淡染，陽性神經元胞體呈梭形、三角形或圓形等形狀，有一個或多個突起；nNOS免疫組化陽性纖維呈棕色串珠狀，且交錯分布。馬倩倩等（2013）通過免疫組化的方法研究發(fā)現，nNOS位于半滑舌鰨大腦神經元胞漿內，陽性神經纖維相互交織呈網狀；小腦顆粒層有nNOS陽性神經元分布，分子層內可觀察到陽性神經纖維和浦肯野細胞。以上研究結果在本研究中得到進一步證實。但孫虎山等（2005）研究發(fā)現，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）神經系統(tǒng)內nNOS免疫組化染色均呈陰性，可能是櫛孔扇貝為低等動物種類，且不同種類動物、不同組織的nNOS分布及數量存在差異所致。

4 結論

大菱鲆腦組織中的NOS類型主要限于nNOS，且nNOS在神經活動中發(fā)揮重要作用，也進一步證實NO在不同物種中具有一些共同的作用，但不同物種或相同物種不同組織中NO分布及含量存在差異。

參考文獻：

陳小囡，張家興，方志明，朱晞. 2002. 一氧化氮合酶陽性神經元在魚腦的分布[J]. 浙江師范大學學報（自然科學版），25（2）：163-165.

Chen X N，Zhang J X，Fang Z M，Zhu X. 2002. Distribution of nitric oxido synthase positive neurons in the brain of fish[J]. Journal of Zhejiang Normal University （Natural Sciences），25（2）：163-165.

梁潤梅. 2003. 神經系統(tǒng)的NO及其生物學功能[J]. 生物學教學，28（4）：3-5.

Liang R M. 2003. NO of nervous system and its biological function[J]. Biology Teaching，28（4）：3-5.

馬倩倩，孫敬鋒，孫萌，張勝根，邢克智. 2013. 半滑舌鰨腦組織中神經型一氧化氮合成酶免疫組織化學定位研究[J]. 水產科學，32（10）：609-612.

Ma Q Q，Sun J F，Sun M，Zhang S G，Xing K Z. 2013. Immunohistochemical localization of neuronal nitric oxide synthase in brain tissue of semi-smooth sole Cynoglossus semilaevis Gunther[J]. Fisheries Science，32（10）：609-612.

沈偉哉，郭國慶，邢旭光，余菁. 2002. 大鼠腦干神經元型一氧化氮合成酶免疫陽性神經元的分布[J]. 解剖學研究，24（2）：138-140.

Shen W Z，Guo G Q，Xing X G，Yu J. 2002. The distribution of neuronal nitric oxide synthase immunopositive neurons in brain stem of rats[J]. Anatomy Research，24（2）：138-140.

孫虎山，王宜艷，王曉安，孫修勤，李光友. 2005. 櫛孔扇貝神經節(jié)一氧化氮合酶的組織化學和免疫組化定位[J]. 中國水產科學，12（1）：20-23.

Sun H S，Wang Y Y，Wang X A，Sun X Q，Li G Y. 2005. Histochemical and immunohistochemical localization of nitric oxide synthase in nervous ganglia of scallop Chlamys farreri[J]. Journal of Fishery Sciences of China，12（1）：20-23.

王曉安，蔣小滿. 2005. 口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）神經系統(tǒng)一氧化氮合酶的NADPH-d組織化學定位研究[J]. 神經解剖學雜志，21（5）：547-552.

Wang X A，Jiang X M. 2005. NADPH-d histochemicalloical localization of nitric oxide synthase in the nervous system of Oratosquilla oratoria[J]. Chinese Journal of Neuroanatomy，21（5）：547-552.

王曉安，陸宇燕，李丕鵬. 2007. 虎斑頸槽蛇腦一氧化氮合酶NADPH-d組織化學定位研究[J]. 四川動物，26（2）：284-287.

Wang X A，Lu Y Y，Li P P. 2007. Histochemistry localization of nitric oxide synthase by using NADPH-d in brain of Rhabdophis tigrinus[J]. Sichuan Journal of Zoology，26（2）：284-287.

鄔曉敏，金成. 2005. 一氧化氮在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育中的作用[J]. 解剖科學進展，11（4）：358-361.

Wu X M，Jin C. 2005. Roles of nitric oxide in the development of central nervous system[J]. Progress of Anatomical Sciences，11（4）：358-361.

張朝再，董雷，牟鳳輝，楊曉虹，孫薇. 2014. 神經型一氧化氮合酶抑制劑的研究進展[J]. 藥學學報，49（6）：781-788.

Zhang C Z，Dong L，Mu F H，Yang X H，Sun W. 2014. Progress in the studies on neuronal nitric oxide synthase inhibitors[J]. Acta Pharmaceutica Sinica，49（6）：781-788.

Aley K O，Mccarter G，Levine J D. 1998. Nitric oxide signaling in pain and nociceptor sensitization in the rat[J]. The Journal of Neuroscience，18（17）：7008-7014.

Biswas S P，Jadhao A G，Bhoyar R C，Palande N V，Sinh D P. 2015. Neuroanatomical localization of nitric oxide synthase （nNOS） in the central nervous system of carp，Labeo rohita during post-embryonic development[J]. International Journal of Developmental Neuroscience， 46：14-26.

Gourdon I，Guérin M C，Torreilles J，Roch P. 2001. Nitric oxide generation by hemocytes of the mussel Mytilus galloprovincialis[J]. Nitric Oxide，5（1）：1-6.

Hope B T，Michael G J，Knigge K M，Vincent S R. 1991. Neuronal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，88（7）：2811-2814.

Ling S，Zhou J，Rudd J A，Hu Z，Fang M. 2012. The expression of neurona l nitric oxide synthase in the brain of the mouse during embryogenesis[J]. Anatomical Record，295（3）：504-514.

Mishra O P，Mishra R，Ashraf Q M，Delivoria-Papadopoulos M. 2006. Nitric oxide-mediated mechanism of neuronal nitric oxide synthase and inducible nitric oxide synthase expre-

ssion during hypoxia in the cerebral cortex of newborn piglets[J]. Neuroscience，140（3）：857-863.

Rao S，Lin Z，Drobyshevsky A，Chen L，Ji X，Ji H，Yang Y，Yu L，Derrick M，Silverman R B，Tan S. 2011. Involvement of neuronal nitric oxide synthase in ongoing fetal brain injury following near-term rabbit hypoxia-ischemia[J]. Developmental Neuroscience，33（3-4）：288-298.

Salchner P，Lubec G，Engelmann M，Orlando G F，Wolf G，Sartori S B，Hoeger H，Singewald N. 2004. Genetic functional inactivation of neuronal nitric oxide synthase affects stress-related Fos expression in specific brain regions[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，61（12）：1498-1506.

Singru P S，Sakharkar A J，Subhedar N. 2003. Neuronal nitric oxide synthase in the olfactory system of an adult teleost fish Oreochromis mossambicus[J]. Brain Research，977（2）：157-168.

Singru P S，Sakharkar A J，Mazumdar M，Subhedar N. 2007. Neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity in forebrain，pineal，and pituitary of Oreochromis mossambicus （tilapia）[J]. Fish Physiology and Biochemistry，33（4）：297-309.

Yu S Y，Zhang M H，Luo J X，Zhang L，Shao Y，Li G. 2013. Curcumin ameliorates memory deficits via neuronal nitric oxide synthase in aged mice[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry，45：47-53.

Zou S，Somvanshi R K，Paik S，Kumar U. 2015. Colocalization of cannabinoid receptor 1 with somatostatin and neuronal nitric oxide synthase in rat brain hypothalamus[J]. Journal of Molecular Neuroscience，55（2）：480-491.

（責任編輯 蘭宗寶）