橡膠樹乳管表達HbHMGR1基因雙元表達載體構(gòu)建與鑒定

賀永國 李哲 黃綿佳 曾憲海 林位夫 劉潔瓊 張春紅 馬曉曉

摘要：【目的】克隆橡膠樹乳管特異性強啟動子HEV2.1（PHEV2.1），構(gòu)建天然橡膠生物合成途徑關(guān)鍵限速酶基因（HbHMGR1）的乳管特異性植物表達載體，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)已報道的HEV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）設(shè)計1對特異引物，采用PCR從橡膠樹熱研7-33-97基因組DNA中克隆PHEV2.1，與HbHMGR1基因融合構(gòu)建橡膠樹乳管特異性植物表達載體，并以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進行鑒定?！窘Y(jié)果】用特異引物可從熱研7-33-97基因組DNA中擴增獲得1852 bp的PHEV2.1片段，其與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%。將PHEV2.1與HbHMGR1基因融合構(gòu)建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證明植物表達載體構(gòu)建成功?！窘Y(jié)論】將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

關(guān)鍵詞： 橡膠樹；乳管特異性啟動子PHEV2.1；HbHMGR1基因；植物表達載體；構(gòu)建；鑒定

中圖分類號： S794.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0163-06

0 引言

【研究意義】轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達調(diào)控的主要環(huán)節(jié)，對植物啟動子功能進行研究不僅可以揭示相應(yīng)基因的表達模式，還能為利用植物基因工程技術(shù)實現(xiàn)基因的高效特異性表達提供有效途徑。橡膠蛋白（Hevein）是膠乳的主要成分，可在乳管中高效表達，占可溶性蛋白質(zhì)的50%～70%，其基因家族成員HEV2.1基因啟動子是乳管特異表達的強啟動子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008）。橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1（HbHMGR1）是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），因此利用HEV2.1基因啟動子和HbHMGR1基因構(gòu)建乳管特異性表達載體以轉(zhuǎn)化橡膠樹，對提高橡膠樹的產(chǎn)量具有重要意義。【前人研究進展】早在20世紀60年代橡膠蛋白就已被認識（Archer，1960），但在隨后的40年間除Broekaert等（1990）成功克隆獲得過一個編碼橡膠蛋白的cDNA序列（GenBank登錄號M36986）外，有關(guān)編碼橡膠蛋白基因及啟動子的研究鮮有報道。2005年，Pujade-Renaud等利用文庫篩選法從橡膠樹基因組DNA中分離獲得5個編碼橡膠蛋白的基因，首次證明橡膠蛋白是由一個小基因家族所編碼；同時克隆獲得HEV1.1啟動子（PHEV1.1）和HEV2.1啟動子（PHEV2.1），并融合uidA基因轉(zhuǎn)化水稻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子均能在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動uidA基因的表達，且以PHEV2.1的功能最強，能驅(qū)動uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平表達。Montoro等（2008）利用PHEV2.1融合uidA基因，并轉(zhuǎn)化橡膠樹分析其表達特性，結(jié)果表明，PHEV2.1驅(qū)動uidA基因在根、莖、葉的乳管中特異性強表達，印證了Archer等（1969）關(guān)于橡膠蛋白在乳管細胞中特異性表達的觀點；隨后還發(fā)現(xiàn)PHEV2.1可受光誘導(dǎo)，驅(qū)動uidA基因在葉片所有細胞類型中表達。【本研究切入點】目前尚無利用PHEV2.1構(gòu)建HbHMGR1乳管特異性表達載體的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過提取橡膠樹高產(chǎn)品種葉片基因組DNA，克隆橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1，用其構(gòu)建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以期為下一步橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97的幼嫩葉片采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所橡膠樹國家種質(zhì)圃，用于提取基因組DNA。植物表達載體pCAMBIA2301-MCS（T-DNA：35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A）與HbHMGR1基因由農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室提供；pCAMBIA3301載體由海南大學畢政鴻惠贈；大腸桿菌Trans5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自美國Omega公司；限制性內(nèi)切酶Hind III、Pst I和Xma I購自美國NEB公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA提取 橡膠樹葉片基因組DNA提取參照鐘淦彬等（2010）和鄒智等（2014）的方法進行小量提取。

1. 2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1克隆 根據(jù)Pujade-Renaud等（2005）報道的HEV2.1序列（NCBI登錄號AY247789）截取起始密碼子前的1830 bp堿基序列，用Primer 5.0設(shè)計1對特異性引物PHF1（5'-CCC

因組DNA為模板，以PHF1和PHR1為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾“A”后，克隆至pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，經(jīng)12～16 h的培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測，選取PCR檢測呈陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTn工具進行序列同源性分析。

1. 2. 3 HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構(gòu)建及酶切鑒定 分別以Xba I和Xma I對pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段，將兩片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測，提取陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用Hind III和Pst I分別對pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1進行雙酶切，電泳結(jié)束后對pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段進行切膠回收，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測，提取陽性重組質(zhì)粒，并用Hind III、Pst I和Xma I對其進行酶切鑒定，確認是否得到陽性重組質(zhì)粒為pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用Hind III和Xma I將PHEV2.1-HbHMGR1重組片段從pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I間，獲得植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，挑取單菌落進行菌落PCR，提取陽性重組質(zhì)粒，用Hind III和Xma I進行酶切鑒定，確認HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構(gòu)建是否成功。

2 結(jié)果與分析

2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA的提取結(jié)果

從橡膠樹熱研7-33-97的葉片中小量提取基因組DNA，取2.0 μL稀釋5倍后進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其純度。由圖1可以看出，提取獲得的橡膠樹葉片基因組DNA條帶整齊、清晰、完整性好、無明顯的雜質(zhì)和降解現(xiàn)象。利用微型紫外分光光度計測定，其濃度約100 ng/μL。

2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1的克隆及序列分析結(jié)果

以橡膠樹熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板，用特異性引物PHF1和PHR1進行PCR擴增，獲得一條近2000 bp左右的條帶。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序結(jié)果證實，從熱研7-33-97基因組中擴增獲得的PHEV2.1為1852 bp。將所獲得的序列錄入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫（http：//blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi？ PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-

rch&LINK_LOC=blasthome）與Pujade-Renaud等（2005）報道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）進行同源性比對分析，結(jié)果顯示，克隆獲得的PHEV2.1啟動子序列與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%，相對于AY247789.1啟動子序列（以此堿基序號為準），其差異主要表現(xiàn)為：164G突變?yōu)門，475T和476T間多了一個AT， 582T突變?yōu)锳，591T和592T間多了一段CACA

TATTTTGCCTCTGTT序列，845C突變?yōu)門，874A和875T間多了一個A。

2. 3 植物表達載體的酶切鑒定結(jié)果

分別采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行酶切，其中，三酶切獲得一條與雙酶切等同的大片段和一條近2000 bp的條帶，近2000 bp的條帶為大小相近的PHEV2.1片段（1852 bp）和HbHMGR1片段（1728 bp），兩者由于大小相近而重疊顯示為一條條帶。此外，雙酶切獲得的小片段介于3000～5000 bp，與3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重組片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行PCR擴增，也獲得一條介于3000～5000 bp的條帶，與雙酶切獲得的小片段一致，說明中間植物表達載體pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已構(gòu)建成功。

提取質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以pCAMBIA2301-MCS為陰性對照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1為陽性對照，分別采用Hind III和Xma I對其進行雙酶切，結(jié)果表明，pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1經(jīng)雙酶切后得到一條與陽性對照小片段等同且介于3000～5000 bp的小片段和一條在10000 bp以上的大片段，小片段與PHEV2.1-

3 討論

由于生物具有遺傳多樣性，即使是同一物種不同品種間的基因組DNA在遺傳組成上也存在差異，從不同品種基因組中克隆獲得的同源啟動子也時有差異。魯旭（2014）在研究橡膠樹HbFCA功能時，用DNAMAN軟件對比了克隆自熱研7-33-97、邊沁橡膠、少花橡膠、光亮橡膠、光亮矮生橡膠、2131野生種、色寶橡膠、熱研幼花和熱研預(yù)測等9個橡膠樹品種的HbFCA啟動子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個品種的HbFCA啟動子同源性為98.77%，其中熱研幼花與熱研預(yù)測的相似性達99.95%。這種現(xiàn)象同樣存在于單子葉植物中，蕭鳳回（2008）通過分析大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)基因LEA啟動子，發(fā)現(xiàn)克隆自不同品種的同源啟動子序列間均存在一定差異。本研究根據(jù)Pujade-Renaud等（2005）報道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）設(shè)計引物，以橡膠樹熱研7-33-97的基因組DNA為模板，多次PCR擴增均獲得一段1852 bp的序列，經(jīng)BLASTn比對分析證實，多次克隆獲得的序列均相同，但與Pujade-Renaud等（2005）克隆自橡膠樹品種RRIM600的PHEV2.1序列略有差異，同源性為98.6%。

HbHMGR1是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），其基因在乳管中特異性表達（Chye et al.，1991）。因此，提高HbHMGR1基因在橡膠樹乳管中的表達量，對促進橡膠的生物合成及提高其產(chǎn)量具有重要意義。原始的植物表達載體pCAMBIA2301理論上只有唯一的1個Pst I限制性酶切位點，但實際應(yīng)用中的pCAMBIA2301載體上常存在2個突變增加的Pst I酶切位點。為此，本研究將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上，經(jīng)雙酶切后再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-

PHEV2.1-HbHMGR1。該研究結(jié)果為進一步利用乳管特異性表達載體轉(zhuǎn)化橡膠樹及研究HbHMGR1基因在乳管中表達促進膠乳生物合成的機理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題，成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

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（責任編輯 蘭宗寶）