循環(huán)腫瘤DNA在結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展

余柳瑩 鮑軼

[摘要] 作為液體活檢的一部分，ctDNA檢測(cè)因其實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)、可重復(fù)性等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被廣泛研究。隨著生活方式的改變，結(jié)直腸癌越來越高發(fā)，而ctDNA在協(xié)助結(jié)直腸癌早期診斷，療效監(jiān)測(cè)，復(fù)發(fā)預(yù)防等方面發(fā)揮重要作用，這在實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)化治療方面有巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

[關(guān)鍵詞] 液體活檢;循環(huán)腫瘤DNA;結(jié)直腸癌;診斷

[中圖分類號(hào)] R735.34? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）01-0161-04

Clinical application and research progress of circulating tumor DNA in colorectal cancer

YU Liuying1， 2? ?BAO Yi1， 2

1.Graduate School of Bengbu Medical College， Bengbu? ?233000， China; 2.Department of Central Laboratory， Jiaxing Second Hospital， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] As part of liquid biopsy， ctDNA detection has been widely studied due to its real-time dynamic， non-invasive and reproducible advantages. With the change of lifestyle， colorectal cancer is getting increasing incidence. While ctDNA plays an important role in assisting early diagnosis of colorectal cancer， monitoring of curative effect， prevention of recurrence， etc.， which has great potential development in achieving accurate treatment of colorectal cancer.

[Key words] Liquid biopsy; Circulating tumor DNA; Colorectal cancer; Diagnosis

近年來，隨著生活環(huán)境和方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率越來越高，年輕化趨勢(shì)也越來越明顯。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2015年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例376 300人，死亡人數(shù)19 100人。如果能早期確診，檢測(cè)基因突變，指導(dǎo)用藥，動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這對(duì)于提高患者生存率、改善預(yù)后有非常大的價(jià)值。

組織病理活檢是確診腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但其反映的是腫瘤在某一時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)，不能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的改變，且組織活檢是一種有創(chuàng)手段，可能會(huì)使患者出現(xiàn)相應(yīng)的并發(fā)癥。因此，無創(chuàng)且能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的“液體活檢”技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測(cè)即其中的一種。循環(huán)腫瘤DNA不僅可作為結(jié)直腸癌的一種生物學(xué)標(biāo)志物，還能監(jiān)測(cè)出基因突變情況，預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，進(jìn)行療效和預(yù)后評(píng)估，對(duì)早期診斷、改善患者預(yù)后有重要價(jià)值。本文就ctDNA在結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展作一綜述。

1 ctDNA的來源與特性

1948年，Mandel和Métais在外周血中發(fā)現(xiàn)存在大量的降解的DNA片段，稱為循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）[2]，主要來自于壞死或凋亡的細(xì)胞，片段長(zhǎng)度集中在180～200 bp，可在血液、尿液、痰液、腦脊液、滑膜液、糞便中被檢測(cè)到。數(shù)十年后，人們發(fā)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA（ctDNA），是指由腫瘤細(xì)胞脫落或者凋亡后釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的雙鏈DNA片段。ctDNA為cfDNA的一部分，ctDNA只來源于腫瘤細(xì)胞，而cfDNA既可來源于腫瘤細(xì)胞也可來源于正常細(xì)胞。雖然ctDNA由腫瘤細(xì)胞凋亡后釋放，但其在腫瘤患者體內(nèi)的含量很低，約占整個(gè)cfDNA的1%，甚至只有0.01%[3]。同時(shí)，其半衰期也很短，只有大約2 h。相關(guān)研究表明[4]，ctDNA的遺傳突變信息來自于腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，故ctDNA所攜帶的腫瘤相關(guān)信息與腫瘤組織具有一致的生物學(xué)特性。腫瘤的類型、部位、負(fù)荷、分期、轉(zhuǎn)移灶、血管浸潤等因素均會(huì)影響ctDNA的量，因而，測(cè)量差異較大。ctDNA攜帶患者一定的腫瘤基因信息（包括突變、重排、缺失、插入、基因拷貝數(shù)變異、微衛(wèi)星改變、甲基化等），因此，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的分析可為腫瘤的診治提供重要線索。

2 ctDNA的檢測(cè)方法

2.1 ctDNA的提取

血漿中ctDNA的提取目前有以下幾種方法：鹽析法、酚-氯仿-異戊醇法、微柱吸附法、磁珠吸附法、Qiagen blood Kit法等。提取方法不同，所得到的DNA效率也不同。其中，硅膠膜吸附柱法最為常用[5]，磁珠法假陽性率高于微柱吸附法，而Qiagen blood Kit法相比其他方法對(duì)小片段DNA提取效率最高，穩(wěn)定性也較好[6]。

2.2 ctDNA的檢測(cè)

ctDNA的檢測(cè)包括定量和定性檢測(cè)。定量檢測(cè)主要是指對(duì)其總量進(jìn)行檢測(cè)，而定性則包括檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和雜合性缺失、基因過表達(dá)、甲基化、基因組不穩(wěn)定性、完整性評(píng)估、拷貝數(shù)變化分析、染色體重排分析等不同方面。因ctDNA占cfDNA的含量較少，故定量檢測(cè)時(shí)常建立在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、甲基化特異性PCR、數(shù)字PCR等。近幾年來，數(shù)字PCR一流式技術(shù)BEAMing（beads emulsion amplification magnetic）、PAP法，微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）、全基因組測(cè)序、全外顯子測(cè)序、深度測(cè)序、腫瘤個(gè)體化深度測(cè)序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）、液相色譜法、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system， ARMS）法、NGS高通量檢測(cè)技術(shù)等廣泛被用于ctDNA的定性分析檢測(cè)。其中，BEAMing法敏感性較高，能檢測(cè)出比例在1：10000以下的基因突變，該法已用于臨床試驗(yàn)[7]。CAPP-Seq法采用二代測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)基因組變異并結(jié)合RNA探針捕獲技術(shù)，大大提高了測(cè)序深度，可有效檢測(cè)出ALK與ROS1融合在內(nèi)的各種基因突變[8]。

3 ctDNA在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用

3.1 早期篩查和診斷

雖然癌胚抗原（CEA）等指標(biāo)常作為篩查結(jié)直腸腫瘤的一種標(biāo)記物，但其特異性、敏感性均不是很高，而ctDNA一般存在于腫瘤細(xì)胞中，在正常細(xì)胞中檢測(cè)不出。有研究結(jié)果得出[9]，結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA水平較健康人明顯升高，認(rèn)為將ctDNA與CEA進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可作為結(jié)直腸癌早期篩查的指標(biāo)。

3.2 基因突變檢測(cè)

在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，包括在腺瘤階段，原癌基因KRAS突變是最早的遺傳改變[10]。在結(jié)直腸癌患者的血漿ctDNA也?？蓹z測(cè)到KRAS突變，且ctDNA中KRAS突變狀態(tài)與腫瘤組織存在較高的一致性[11]，這對(duì)于后期指導(dǎo)患者用藥，個(gè)體化治療非常有幫助。有研究分析了206 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA中KRAS突變情況，結(jié)果顯示其敏感性為87.2%，特異性為97.2%[12]。此外，Kidess E等[13]還發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA可檢測(cè)出組織未檢測(cè)出的突變位點(diǎn)，同時(shí)在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移時(shí)血漿ctDNA比CEA和影像學(xué)檢查更及時(shí)，這對(duì)于結(jié)直腸癌患者來說又是一大福音。

3.3 完整性評(píng)估

DNA中的短分散重復(fù)序列ALU序列以及cfDNA完整性指數(shù)CFDI（即ALU長(zhǎng)、短片段含量的比值）可間接反映ctDNA含量，這在結(jié)直腸癌診斷中得到廣泛研究。2013年，Da等[14]學(xué)者對(duì)60例CRC患者及33例健康者進(jìn)行對(duì)照研究，結(jié)果顯示，手術(shù)組（33例）患者血漿CFDI均值（0.08）顯著大于健康對(duì)照組（P<0.01）、非手術(shù)組（27例）患者與健康對(duì)照組（P=0.019）、手術(shù)組與非手術(shù)組（P=0.005）以及手術(shù)組與健康對(duì)照組（P=0.043）。以上幾組血漿CFDI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hao TB等[15]對(duì)結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA中ALU重復(fù)序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其ALU247/115明顯高于結(jié)腸息肉患者及健康對(duì)照者，且術(shù)后其含量明顯降低，表明ctDNA的完整性在CRC的診斷中也有一定價(jià)值，可用于臨床診斷及療效評(píng)估。

3.4 ctDNA甲基化

DNA甲基化是指DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl transferase，DNMT）的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸的甲基，將甲基基團(tuán)合成到胞嘧啶的5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶。Grützmann R等[16]與Warren JD等[17]學(xué)者開展的早期結(jié)直腸癌的回顧性研究中，對(duì)比不同分期CRC患病人群的血漿ctDNA中SEPT9啟動(dòng)子甲基化水平，結(jié)果顯示，ctDNA甲基化對(duì)CRC診斷的敏感度為72%～90%，特異度為88%～90%。同樣，Danese E等[5]也發(fā)現(xiàn)在早期結(jié)直腸癌患者中SEPT9啟動(dòng)子甲基化比率明顯高于KRAS突變的比率，這可能與抑癌基因甲基化比癌基因突變更穩(wěn)定相關(guān)，也可能與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，因此，ctDNA異常甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查或診斷中的應(yīng)用已更快的從基礎(chǔ)研究走向臨床。

3.5藥物篩選

有研究報(bào)道，ctDNA的濃度與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)，與有效藥物治療或手術(shù)治療呈負(fù)相關(guān)。通過ctDNA的基因分析來尋找結(jié)直腸癌患者的藥物敏感的突變位點(diǎn)，這對(duì)于臨床用藥具有很好的指導(dǎo)意義，如西妥昔單抗對(duì)KRAS突變的結(jié)腸癌有很好療效[18]。但結(jié)直腸癌患者在臨床治療過程中往往會(huì)出現(xiàn)耐藥或?qū)λ幬锏挚骨闆r，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)臨床用藥進(jìn)展，及時(shí)調(diào)整藥物治療，能使患者臨床獲益更大。Spindler KL等[19]在檢測(cè)結(jié)直腸癌患者ctDNA中的KRAS突變情況過程中，發(fā)現(xiàn)血漿KRAS的突變狀態(tài)或突變量與耐藥相關(guān)。另一類似研究發(fā)現(xiàn)[12]，原發(fā)性結(jié)直腸癌患者血漿中的KRAS DNA片段原未檢測(cè)出16號(hào)密碼子突變，但使用EGFR阻滯劑治療后，患者血漿ctDNA中KRAS的突變頻率顯著升高，檢出率約為46%。Diaz LA等[20]研究中選取KRAS野生型的轉(zhuǎn)移性CRC患者，經(jīng)靶向治療后仍有部分患者發(fā)生耐藥，發(fā)現(xiàn)在治療前檢測(cè)患者血漿ctDNA中KRAS基因突變情況，已有低頻亞克隆的突變存在，只是當(dāng)時(shí)受限于某些條件未被檢測(cè)出。另外，還可通過定量檢測(cè)基因拷貝數(shù)的增加來預(yù)測(cè)療效，例如使用定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA中KRAS突變水平，低水平的KRAS突變說明使用第三代西妥昔單抗和伊立替康治療后療效尚可，而高水平血漿KRAS突變則提示靶向治療后預(yù)后不良或出現(xiàn)耐藥[12]。吳疑等[21]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者使用EGFR單克隆抗體治療后，通過監(jiān)測(cè)ctDNA，可發(fā)現(xiàn)其存在RAS/RAF基因變異，說明患者對(duì)上訴藥物發(fā)生耐藥現(xiàn)象。通過監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA中靶向治療相關(guān)基因譜的變化，有望以此來指導(dǎo)臨床治療，調(diào)整靶向藥物，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療和精準(zhǔn)治療。

3.6療效與預(yù)后評(píng)估

邢寶才等[22]發(fā)現(xiàn)，血漿ctDNA能更早且及時(shí)的進(jìn)行療效評(píng)估，術(shù)前化療的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，血漿ctDNA在化療2周期后即可檢測(cè)出顯著下降，而CT評(píng)價(jià)只能在化療開始后的8～10周后才能進(jìn)行。有研究[12]檢測(cè)了108例行西妥昔單抗和伊立替康聯(lián)合化療的轉(zhuǎn)移性CRC患者治療前血漿ctDNA中KRAS和BRAF基因突變定量基線水平，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，KRAS突變水平高于75%的患者，相比低突變水平的患者疾病控制率差（P<0.048）。Lecomte T等[23]對(duì)37例CRC患者進(jìn)行生存分析的研究中發(fā)現(xiàn)，患者發(fā)生KRAS基因突變2年整體生存率僅48%（95%CI為26%～66%），而未發(fā)生基因突變者2年整體生存率可達(dá)100%。以上兩項(xiàng)研究的COX回歸分析均證實(shí)，結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA中KRAS基因突變是預(yù)后的獨(dú)立因素，KRAS基因突變水平越高，CRC患者的預(yù)后越差，這對(duì)有效評(píng)估CRC患者預(yù)后具有重要價(jià)值。

3.7復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)

ctDNA被認(rèn)為是結(jié)直腸癌切除術(shù)后監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和殘留病灶的潛在標(biāo)志物。有研究監(jiān)測(cè)了結(jié)直腸癌患者術(shù)后2～5年ctDNA的情況，結(jié)果顯示術(shù)后ctDNA陽性患者腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而未檢測(cè)到ctDNA的患者沒有復(fù)發(fā)[3]。有研究也得出了類似結(jié)論，且認(rèn)為檢測(cè)ctDNA時(shí)間應(yīng)在手術(shù)后（一般為手術(shù)后6～8周）、輔助治療之前。在對(duì)18例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，第一次局部切除腫瘤時(shí)，患者血漿ctDNA含量沒有降低，第二次完全切除腫瘤時(shí)，患者血漿ctDNA含量明顯降低[3]。因此，ctDNA有望成為監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

4 ctDNA存在的缺點(diǎn)

血漿ctDNA檢測(cè)雖然在結(jié)直腸癌的早期診斷，基因突變檢測(cè)，療效評(píng)價(jià)，預(yù)后評(píng)估等方面有較大的價(jià)值。但ctDNA檢測(cè)本身仍存在一些不足：（1）臨床上暫時(shí)沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)表明哪一種方法提取和純化ctDNA是最佳的，因此檢測(cè)方式不同會(huì)導(dǎo)致結(jié)果差異較大。（2）ctDNA在血漿中的含量較少，檢測(cè)較為困難，需尋找能提高血漿ctDNA富集量的方法。（3）ctDNA尚無準(zhǔn)確的閾值來判斷陽性指標(biāo)，如轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)等。（4）若ctDNA與影像學(xué)檢查、CEA等傳統(tǒng)診斷方法的不一致時(shí)，判斷較為困難。而在檢測(cè)技術(shù)方面也存在一些缺點(diǎn)：（1）檢測(cè)技術(shù)花費(fèi)較大，有些患者較難接受。（2）檢測(cè)方法較多，醫(yī)生和患者較難選擇。（3）檢測(cè)技術(shù)的許多機(jī)制尚未闡明，可靠性有待檢驗(yàn)。

5 展望

“液體活檢”作為一項(xiàng)新起的前沿技術(shù)，在腫瘤的診斷、評(píng)估、監(jiān)測(cè)中有巨大潛力[24]。血漿ctDNA檢測(cè)作為液體活檢技術(shù)的一部分，在結(jié)直腸癌的早期篩查、診斷、基因突變檢測(cè)、病情及療效評(píng)估、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)等方面都存在較大的價(jià)值。但目前國內(nèi)外較多的研究還只是停留在小范圍的臨床樣本上，缺乏大數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，未能真正的廣泛應(yīng)用于臨床。故我們需要更多大樣本、前瞻性的研究來證明ctDNA的價(jià)值，同時(shí)解決ctDNA一些可攻克的困難，從而在臨床上真正實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化和精準(zhǔn)治療。目前，結(jié)直腸癌的患者越來越多，ctDNA也許能成為結(jié)直腸癌診斷、治療、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)上的一個(gè)新的突破點(diǎn)，給廣大患者帶去福音。

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