生物電子顯微學(xué)技術(shù)在農(nóng)業(yè)高等院校研究生教學(xué)中的應(yīng)用與實踐

王金泉 吳輝 王琦 翟少華

摘要：電子顯微鏡是一種超微結(jié)構(gòu)分析精密儀器，主要用于觀察被檢測樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)特征變化的研究。隨著電鏡功能和檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，其與農(nóng)學(xué)、動物醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)、園林、食品與藥品、草業(yè)與環(huán)境等農(nóng)學(xué)生命科學(xué)科的應(yīng)用越加緊密。在農(nóng)業(yè)高等院校研究生教學(xué)中開設(shè)《生物電子顯微鏡技術(shù)課程》，可以有效地提升各學(xué)科整體教學(xué)質(zhì)量和科研能力，為提升農(nóng)業(yè)高等院校教學(xué)和科研發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：生物電子顯微學(xué)；農(nóng)業(yè)高等院校；研究生；教學(xué)

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）30-0152-02

電子顯微鏡是一種超微結(jié)構(gòu)分析精密儀器，主要用于觀察被檢測樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)特征變化的研究。隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展與農(nóng)學(xué)、動物醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)、園林、食品與藥品、草業(yè)與環(huán)境等農(nóng)學(xué)生命科學(xué)科的應(yīng)用越加緊密[1]。在農(nóng)業(yè)專業(yè)學(xué)科的教學(xué)和科研中，可通過電子顯微鏡對動物和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁、生物膜、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、微體、中心體、細(xì)胞骨架和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物（如糖原、脂類、蛋白質(zhì)），以及細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)；微生物超微結(jié)構(gòu)如：菌體鞭毛、菌毛、芽孢、莢膜等結(jié)構(gòu)、病毒的囊膜、衣殼、霉病菌菌絲和孢子等形態(tài)，以及化工材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)元素分析，含水樣品、含油樣品、放氣樣品、加熱樣品、冷凍樣品進(jìn)行觀察工作。因此，在農(nóng)業(yè)高等院校研究生教學(xué)中開設(shè)《生物電子顯微鏡技術(shù)課程》，可以有效地提升各學(xué)科整體教學(xué)質(zhì)量和科研能力，為教學(xué)和科研服務(wù)。

一、《生物電子顯微學(xué)技術(shù)》課程的教學(xué)內(nèi)容與要求

1.《生物電子顯微學(xué)技術(shù)》課程的理論教學(xué)內(nèi)容?！渡镫娮语@微鏡技術(shù)》理論課程20學(xué)時，教學(xué)內(nèi)容包括：電子顯微鏡的發(fā)展與應(yīng)用、透射電子顯微鏡原理與制樣、掃描電子顯微鏡原理與制樣、免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、冷凍切片技術(shù)與冰凍蝕刻、酶電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、生物大分子電鏡超微細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡原位分子雜交技術(shù)。

2.《生物電子顯微學(xué)技術(shù)》課程的實驗教學(xué)要求。在實驗教學(xué)中要使學(xué)生掌握儀器的基本操作方法，生物樣品超薄切片技術(shù)、半薄切片技術(shù)、負(fù)染技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)定位技術(shù)、掃描電鏡臨界點干燥技術(shù)、離子濺射技術(shù)、細(xì)胞冰凍蝕刻技術(shù)等樣品制備方法，使學(xué)生能夠?qū)W會運用電子顯微鏡技術(shù)對動植物組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能的研究方法和技術(shù)手段。

二、生物電子顯微鏡技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用

1.免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法[2]。目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)?？捎糜谵r(nóng)業(yè)作物抗旱、抗旱品種選育，品種間生長發(fā)育組織學(xué)特性表征抗原的定位分析；動物疾病微生物學(xué)鑒定、診斷和致病機制研究；動物組織胚胎發(fā)育，干細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育研究，動物腫瘤的組織學(xué)診斷；林果品種發(fā)育結(jié)構(gòu)特征等領(lǐng)域的科研研究。

2.冷凍切片技術(shù)與冰凍蝕刻在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。冷凍切片技術(shù)是利用液氮快速冷凍技術(shù)，在冷凍超薄切片機中進(jìn)行冷凍切片。省去了傳統(tǒng)的戊二醛/俄酸固定、乙醇脫水、丙酮置換等有機溶劑操作過程，避免了化學(xué)藥劑的處理，樣品結(jié)構(gòu)、成分不發(fā)生變化，實現(xiàn)快速固定，快速制片、快速研究與診斷的能力，保持了細(xì)胞或組織的生物活性物質(zhì)的原始狀態(tài)。冷凍蝕刻技術(shù)是利用物理冷凍斷裂方法對生物樣品組織細(xì)胞進(jìn)行斷裂和復(fù)型相結(jié)合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，用透視型電子顯微鏡觀察細(xì)胞或細(xì)胞器的內(nèi)、外表面微細(xì)的三維結(jié)構(gòu)或膜內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)分析的方法[3]。可用于動植物新鮮組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、生物大分子和某些元素在組織內(nèi)分布、免疫抗原電鏡標(biāo)記、細(xì)胞酶活性標(biāo)記、電鏡放射自顯影等細(xì)胞的化學(xué)和細(xì)胞成分的定量定性分析。

3.酶電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是通過酶的特異性細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位技術(shù)。一般先將酶原位固定在細(xì)胞內(nèi)，再使它與特定的底物起反應(yīng)，底物的分解物經(jīng)過捕捉反應(yīng)沉著于發(fā)生分解的原位上，最后使沉著物變?yōu)樵陔婄R下可以看到的物質(zhì)。在整個處理過程中必須保存酶的活性不受破壞。目前能在電鏡下定位的酶有三大類即水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶[4]。

電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于農(nóng)作物棉花、小麥、玉米、水稻等作物的生長發(fā)育、品種選育、營養(yǎng)成分檢測等方面研究；動物生長代謝機制、不同畜禽品種間組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理生化機制差異；牛、羊等畜產(chǎn)品貯藏方法和無公害研究；動物超微解剖學(xué)、動物生理功能機制、動物發(fā)病機制、動物病原微生物形態(tài)、動物免疫學(xué)機制、動物藥物作用機理、藥物成分和結(jié)構(gòu)等方面研究工作。

4.電鏡放射自顯影技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。放射自顯影技術(shù)是利用放射性核素所產(chǎn)生的射線作用于感光乳膠的鹵化銀晶體而產(chǎn)生潛影，再經(jīng)過顯影定影處理，把感光的鹵化銀還原成黑色的銀顆粒，即可根據(jù)這些銀顆粒的部位和數(shù)量分析出標(biāo)本中放射性示蹤物的分布，以進(jìn)行定位和定量分析[5]?？赏ㄟ^放射自顯影技術(shù)定位功能，對組織樣品的結(jié)構(gòu)研究和目的成分檢測進(jìn)行分析，可應(yīng)用于動物組織細(xì)胞的活性蛋白表達(dá)、活性物質(zhì)的組織分布、檢測物質(zhì)的組織定位，以及腫瘤、免疫疾病、傳染性疾病的特異性診斷；生物肥料物質(zhì)的吸收及植株內(nèi)的動態(tài)分布，抗旱、抗旱功能蛋白的組織內(nèi)定位，組織內(nèi)的原位雜交等功能研究。

5.生物大分子電鏡超微細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。生物大分子是構(gòu)成生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸、碳?xì)浠衔锏取Ｓ捎谄涞拖鄬Ψ肿恿康挠袡C化合物經(jīng)過聚合而成的多分子體系。生物大分子在各種生物活性和在生物新陳代謝中發(fā)揮重要作用[6]。通過電子顯微鏡技術(shù)可以觀察生物大分子的理化特性及空間構(gòu)像與功能研究；核酸分子的形狀和長度、雙鏈或單鏈的區(qū)分、根據(jù)長度計算核酸的分子量；進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究；基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面的研究。應(yīng)用范圍涉及到生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物、遺傳發(fā)育、食品、藥理、生理、醫(yī)學(xué)、病理、植物、神經(jīng)科學(xué)等的研究工作。

6.電鏡原位分子雜交技術(shù)在農(nóng)學(xué)專業(yè)研究生教學(xué)中的應(yīng)用。原位雜交技術(shù)是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸（即探針）與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來[7，8]。自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來這一技術(shù)為基因的定位和表達(dá)、基因進(jìn)化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料，發(fā)揮了其他技術(shù)難以取代的作用，近年來這一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸向電鏡水平發(fā)展以提高檢測的分辨率。

三、展望

電子顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)的研究和應(yīng)用地位日顯重要，其穩(wěn)定性、操作性的改善，更高分辨率依舊是電鏡發(fā)展的最主要方向。高性能場發(fā)射槍電子顯微鏡日趨普及和應(yīng)用、電子顯微鏡分析工作邁向計算機化和網(wǎng)絡(luò)化、高性能CCD相機日漸普及應(yīng)用、低溫電鏡技術(shù)和三維重構(gòu)技術(shù)等電鏡新興檢測技術(shù)的發(fā)展，可以為生命科學(xué)的研究提供重要的研究工具，可以極大地提升生物形態(tài)學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。也可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科學(xué)養(yǎng)殖、動物疫病、林果產(chǎn)業(yè)、水土資源、水利水電、化工工業(yè)的發(fā)展和科研提供技術(shù)條件，為新疆整體科研實力的提升和農(nóng)業(yè)高校的學(xué)科建設(shè)與發(fā)展，提供科研平臺[9，10]。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉學(xué)春，郭延奎，崔德才.高等林業(yè)院校生物顯微鏡技術(shù)教學(xué)模式的研究與實踐[J].中國農(nóng)業(yè)教育，2001，（06）：36-38.

[2]李文財，周常勇.免疫電顯鏡技術(shù)在植物病毒研究中的應(yīng)用[J].南方農(nóng)業(yè)，2011，（05）：84-86.

[3]朱小東，曾彩虹，劉志紅.冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)在腎活檢病理中的應(yīng)用[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2013，22（03）：293-298.

[4]付宇.鹽堿脅迫下星星草根H+—ATP酶超微細(xì)胞化學(xué)定位研究[D].東北林業(yè)大學(xué)碩士研究生論文，2010.

[5]范永增，袁耿彪，朱曉娥.包裹放射性核素131I的高分子納米藥物的制備及其放射性自顯影實驗[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（12）：1203-1206.

[6]周建平.攜帶抗赤霉病基因的小麥-黑麥小片段易位的分子細(xì)胞學(xué)檢測[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.

[7]何玉英，李健，劉萍.原位雜交技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].海洋水產(chǎn)研究，2005，26（01）：74-79.

[8]周燕，高華，高自旸.染色體原位雜交技術(shù)與植物顯微鏡技術(shù)實驗探索[J].生物通報，2011，46（02）：43-45.

[9]付志強，孟凱.材料電子顯微鏡分析技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展[J].檢驗檢疫學(xué)刊，2009，（03）：72-74.

[10]杜三明，趙飛.探索與實踐：《材料電子顯微分析技術(shù)》課程的教學(xué)改革探討與實踐[J].教育教學(xué)論壇，2011，（20）：123-124.