UPLC—MS/MS法同時檢測5種PDE5 型抑制劑的研究

張艷萍 錢鑫 李翠玲

【摘要】目的：建立同時測定壯陽類中成藥和保健品中可能添加的5種5型磷酸二酯酶（PDE5）型抑制劑UPLC-MS/MS分析方法，方法：采用液質(zhì)聯(lián)用法 ，應(yīng)用C18柱，流動相為含0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脫，質(zhì)譜采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測掃描。 結(jié)果：5種PDE5 型抑制劑線性關(guān)系、精密度均符合方法學(xué)測定要求，加標(biāo)回收率為80.8%～101.9%。結(jié)論：該法操作簡便、快捷、高靈敏度、高準(zhǔn)確性等特點，可同時對中成藥和保健食品中非法添加多種PDE5 型抑制劑進行定性定量分離檢測。

【關(guān)鍵詞】UPLC-MS/MS；壯陽類中成藥；保健食品；PDE5 型抑制劑

【中圖分類號】R284.1 【文獻標(biāo)志碼】A 【文章編號】1007-8517（2016）07-0021-02

Abstract：Objective To establish a UPLC-MS/MS analytical method for the simultaneous analysis of five PDE5 inhibitors in Chinese trandition medicines and Health Food.Methods The separation was performed on C18 column using a gradient elution（0.1% formic acid in water and acetonitrile）. A triple quadrupole mass spectrometer operating in positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring was used.Results five PDE5 inhibitors have good linear relationship and precision according to the requirements of the methodology determination. The recoveries were 80.8%～101.9%.Conclusion the method not only isconvenient，rapid，sensitive and accurate ，but also can be used to separate and detect a variety of PDE5 inhibitors qualitatively and quantitatively in illegally added into anti-importence Chinese trandition medicines and health food at the same time .

Keywords：UPLC-MS/MS；anti-impotence Chinese trandition medicines；health food；PDE5 inhibitor

近年來，一些不法商販利欲熏心，不擇手段，在宣傳具有抗疲勞功效的中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)藥品，其中以添加西地那非、他達那非和伐地那非這3種藥物較為常見[1]，在沒有醫(yī)師指導(dǎo)的情況下，長期大量服用這種非法添加了“壯陽”藥物成分的中成藥和保健食品，有可能對身體造成極大損害。若服用過量，極易引發(fā)毒副作用，會出現(xiàn)頭暈、昏暈、甚至青光眼，造成對腎功能、心臟功能、心血管疾病的嚴重損害。目前，中成藥和保健食品中非法添加壯陽藥物檢驗方法主要有液相色譜法[2-4]和液質(zhì)聯(lián)用法[5-6]，國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布了藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件編號2009030補腎壯陽類中成藥中PDE5 型抑制劑的快速檢測方法，主要采用理化反應(yīng)法、液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用（一級、二級掃描法）來對中成藥和保健食品中非法添加的PDE5 型抑制劑進行定性。而本文采用UPLC-MS/MS多反應(yīng)檢測方法對中成藥和保健食品中非法添加的那紅地那非、紅地那非、西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非進行定性和定量，該方法具有準(zhǔn)確、可靠、靈敏度更高，可為分析檢測中成藥和保健食品領(lǐng)域的打假行動提供準(zhǔn)確可靠的技術(shù)保障。

1 儀器與試劑

美國Waters xevo TQ 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀；美國MS2漩渦振搖器；瑞士梅特勒-托利多AB265-S電子天平；昆山KQ-250B超聲波清洗器。對照品那紅地那非（批號520039-201401）、紅地那非（批號520039-201401）、枸櫞酸西地那非、硫代艾地那非（批號250048-201401）、偽伐地那非（批號520041-201401）購自中國食品藥品檢定研究院，各對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%；乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的配制

2.1.1 對照品混合標(biāo)儲備溶液的制備 分別稱取上述5種對照品各約10mg，加乙腈溶解并定容至20ml容量瓶，濃度為0.5mg/ml的對照品單標(biāo)儲備溶液。

2.1.2 對照品混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備 精密量取各單標(biāo)物質(zhì)適量，用20%乙腈溶液稀釋成不同濃度的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度范圍為0.2～5.0μg/ml。

2.1.3 對照品混合使用溶液系列的制備 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml至5ml容量瓶，用20%乙腈水溶液定容，配制濃度范圍為0.004～0.50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取供試品約0.50g于25ml容量瓶中，加20%乙腈水溶液定容，旋渦振蕩2min后，超聲處理15min，過濾，取上清液過0.22μm微孔濾膜，待測，如樣品濃度超出線性，需對供試品溶液進行適當(dāng)稀釋。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm），流動相為乙腈 （A）-含0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0.0min，20% A；0.0～4.9min，20%～ 70%A；4.9～5.0min，70%～95%A；5.0～7.0min， 95%A； 7.0～7.1min ，95%～ 20%A； 7.1～10min ，20% A； 柱溫：40℃， 流速：0.30 ml/min， 進樣量：1μ1。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，離子源溫度： 150℃，毛細管電壓：3.5KV，脫溶劑溫度：500℃，錐孔氣流量（氮氣）：50L/h；碰撞氣流速（氬氣）：0.15 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），其各物質(zhì)母離子、定量離子、錐孔電壓、碰撞電壓見表1，MRM 離子流圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性試驗 取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進液質(zhì)聯(lián)用儀，以峰面積對濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸分析，各物質(zhì)濃度在各自濃度范圍內(nèi)線性良好。按照樣品稱樣量0.5g，定容10ml，以儀器3倍噪聲值表示方法檢出限，10倍噪聲值表示方法定量限來計算，結(jié)果見表2。

2.5 方法精密度和回收率實驗 向一份未檢出上述5種PDE5 型抑制劑的中成藥中添加低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2進行樣品處理，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測定，計算精密度和回收率。結(jié)果表明：5種PDE5 型抑制劑加標(biāo)回收率為80.8%～101.9%， RSD為2.0%～5.1%，均能滿足方法學(xué)要求。結(jié)果見表3。

2.6 方法應(yīng)用 在本實驗條件下，對監(jiān)督抽驗的市售42批中成藥和25批保健食品進行上述5種PDE5 型抑制劑的檢測，在20份中成藥和17批保健食品中檢出西地那非，含量為34.1～956.4mg/kg，檢出率為55.2%。

3 討論

本實驗選擇了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液系統(tǒng)，考察了不同的流動相系統(tǒng)對物質(zhì)分離、色譜峰拖尾等影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動相中添加甲酸可以提高ESI電離源正離子檢測方式下的質(zhì)譜響應(yīng)，有利于改善峰形，且分離效果最好，最終確定流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)，嘗試不同的流動相比例的梯度程序，確認使用前述梯度條件，各物質(zhì)峰型較好，并在6min內(nèi)5種物質(zhì)能分離完全。同時為減少溶劑效應(yīng)，提取溶劑選擇20%乙腈水溶液。

本實驗考察了不同類型不同長度的色譜柱，最終選擇waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），其保留時間適中，具有較好的分離效能，不易受到干擾。由于中成藥和保健食品成分復(fù)雜，存在眾多干擾物質(zhì)，單純采用HPLC法較難將待測物質(zhì)與干擾物質(zhì)完全分離，本實驗建立的UPLC-MS/MS多反應(yīng)檢測方法可同時用于中成藥和保健食品中非法添加的壯陽類藥物的定性和定量檢測，分析方法靈敏，線性范圍寬，精密度高，回收率好，這些因素保證該法用于中成藥和保健食品中PDE5 型抑制劑的分析能排除背景干擾，為打擊中成藥和保健食品中非法添加PDE5 型抑制劑的監(jiān)督檢驗提供技術(shù)保障。

參考文獻

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（收稿日期：2016.02.01）