純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF—7的生長(zhǎng)影響

劉力豪 蔡琨 王曉敏

【摘要】目的：研究純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在體外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)影響。方法：用不同劑量組對(duì)體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞分別干預(yù)12、24、36、48、72h后，用MTT法觀察其對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)影響。結(jié)果：①純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細(xì)胞12、24、36h，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現(xiàn)出對(duì)MCF-7細(xì)胞穩(wěn)定的抑制作用，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制作用，在一定濃度、作用時(shí)間有依賴關(guān)系，與大豆異黃酮抑制作用相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：純種發(fā)酵淡豆豉有明確的抗乳腺癌的作用，其24h IC50為（7.58±1.57）mg/L。

【關(guān)鍵詞】純種發(fā)酵；淡豆豉；異黃酮；MTT；MCF-7細(xì)胞；乳腺癌

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）07-0023-05

Abstract：Objective To observe the inhibiting effect on isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum （SSP） to MCF-7 cells′ reproductive activity in vitro.Methods MCF-7 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of isoflavones extracts from pure fermented SSP for 12，24，36，72 hours respectively. The inhibition of pure fermented SSP to MCF-7 cells were detected by MTT Method.Results （1）The isoflavones extracts from pure fermented SSP show the inhibition to MCF-7 cells compared with the negative control group，by different concentrations of 5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L for 12h，24h and 36 h （P<0.05），except 24h 10mg/L. （2） Pure fermented SSP could markedly inhibit proliferation of MCF-7 cell line in a time-dependent and dose-dependent manner. The effects of Pure fermented SSP were no difference compared with those of soy isoflavones（P>0.05）.Conclusion The results proved the inhibition of isoflavones extracts from pure fermented SSP show the best inhibiting effect on the proliferation of MCF-7 cells， 24h IC50（7.58±1.57）mg/L.

Keywords：pure fermented， Semen SojaePraeparatum， isoflavones， MTT， breast cancer

淡豆豉是一味以大豆為原材料經(jīng)發(fā)酵而成的傳統(tǒng)中藥，始載于《名醫(yī)別錄》，有解表除煩、宣發(fā)郁熱之功效，適用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥[1]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于成藥之中，如維C銀翹片、銀翹解毒片等。傳統(tǒng)制作淡豆豉的方法見于藥典，使用桑葉、青蒿的煎煮液浸泡大豆晾干后，再用桑葉、青蒿覆蓋初步發(fā)酵，再放入容器發(fā)酵近20d后得淡豆豉，其制法繁瑣、耗時(shí)，缺乏劑量標(biāo)準(zhǔn)，量產(chǎn)需要制作經(jīng)驗(yàn)，且發(fā)酵中易受其他微生物的干擾導(dǎo)致失敗、甚至產(chǎn)生毒素，這些都直接影響淡豆豉的品控、量產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)前期分離得到高效淡豆豉發(fā)酵菌株，量化并優(yōu)化發(fā)酵工序，僅需7d即能高效、安全、穩(wěn)定獲得大量純種發(fā)酵淡豆豉[2-3]。乳腺癌作為女性三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害婦女健康。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群經(jīng)常食用富含植物雌激素的食物，其乳腺癌發(fā)病率較歐美人群明顯降低，而大豆及其相關(guān)制品如豆豉、納豆等則是植物雌激素的主要膳食來源[4-5]，植物雌激素主要包含異黃酮類如大豆苷元、染料木素、木酚類等。有眾多文獻(xiàn)指出[6-8]，大豆異黃酮對(duì)體外癌細(xì)胞有抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究顯示大豆異黃酮中游離形式生物活性相對(duì)非游離型要高，但僅占大豆總異黃酮的2%～3%。大豆發(fā)酵后的淡豆豉總異黃酮量與大豆相當(dāng)，但游離形式苷元是大豆中的10～40倍[9]。因此，淡豆豉可能具有更加理想的防治乳腺癌作用。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥淡豆豉抗腫瘤功能的研究相對(duì)不多，對(duì)于純種發(fā)酵淡豆豉對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的研究更加少見，純種發(fā)酵淡豆豉對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)影響如何則需進(jìn)一步研究。本研究選用前期分離的高效淡豆豉發(fā)酵菌株，并采用前期得出的優(yōu)化發(fā)酵條件發(fā)酵得到純種發(fā)酵淡豆豉，通過一定的提取方法獲得單位質(zhì)量活性物質(zhì)較高的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，用高效液相色譜法測(cè)定提取物主要有效成分含量，以大豆異黃酮作為陽性藥物，使用MTT法檢測(cè)其對(duì)MCF-7癌細(xì)胞的生長(zhǎng)影響，為進(jìn)一步擴(kuò)展純種發(fā)酵淡豆豉的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑 DMEM-H培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Solarbio公司）；0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶（M&C Gene Technology）；實(shí)驗(yàn)所使用其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)，購(gòu)于化學(xué)試劑公司。

1.1.3 藥物 陽性藥物大豆異黃酮購(gòu)于江萊生物公司（精密級(jí)，80%），批號(hào)：JL 150208005；純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物由本課題組制備及提取。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司USA3131型）；離心機(jī)（Thermo公司X1R型）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo公司1510型）；倒置顯微鏡（DSZ2000X型）；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（TOMY公司SX-700型）；高效液相色譜儀HPLC（Agilent公司1260型）；色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；水浴振蕩器；水浴鍋；分析天平；烘箱；96孔培養(yǎng)板及T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 純種發(fā)酵淡豆豉的制備 購(gòu)于市場(chǎng)的干大豆，經(jīng)篩選、室溫清水浸泡（12h）后，使干黃豆充分吸收水分膨脹，晾干，按一定質(zhì)量分裝到大三角燒瓶?jī)?nèi)，經(jīng)15min，115℃處理后冷卻，在超凈臺(tái)內(nèi)無菌操作，接種高效淡豆豉發(fā)酵菌液（按大豆30g∶菌液10ml比例）充分混勻后，于25℃溫箱培養(yǎng)發(fā)酵7d，獲得純種發(fā)酵淡豆豉。

1.2.2 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的制備 將純種發(fā)酵淡豆豉于60℃干燥回收，粉碎，過40目篩，稱取粉末200g，用石油醚脫脂，減壓干燥得到粉末，取100g加入pH=5緩沖液1000ml（由0.2mol/L檸檬酸鈉與0.1mol/L檸檬酸配制成），加入10mg β-葡萄糖苷酶、1000ml乙酸乙酯，45℃、超聲60min，減壓干燥得異黃酮粗品，按粗品、大孔樹脂1∶40比例上AB-8大孔樹脂柱乙醇反復(fù)洗脫，濃縮、干燥得純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物。

1.2.3 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物主要成分含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]，使用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定提取物異黃酮含量，色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），大豆苷元測(cè)定條件：流動(dòng)相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶55∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進(jìn)樣量：10μl。染料木素測(cè)定條件：流動(dòng)相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶65∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)：262nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進(jìn)樣量：10μl。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷元（daidzein，5.25mg）、染料木素（genistein，5.55mg），加80%甲醇溶解，定容至50ml，得0.105 mg/ml 大豆苷元對(duì)照品溶液、0.111 mg/ml染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別精密稱取精密稱取純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物0.5g，用10ml含有2mol/L鹽酸的80%乙醇溶解大豆苷元樣品，用10ml 80%乙醇溶解染料木素樣品，均超聲15min，4000r/min 離心5min，重復(fù)兩次，分別合并提取液，水浴蒸干，用80%的乙醇定容至10ml并經(jīng)0.45μm膜過濾備用。

1.2.4 藥物組的配置 精密稱取1mg純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，充分溶解于5ml無水乙醇中，加入20ml DMEM-H（不加FBS）培養(yǎng)液稀釋上述液體，得20%乙醇混合液，經(jīng)0.22μm膜過濾，用DMEM-H（不加FBS）培養(yǎng)液稀釋得到濃度為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L共8個(gè)濃度異黃酮提取物溶液，同樣方法精密稱取1mg大豆異黃酮制備以上8個(gè)濃度，全部密封、4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 MCF-7細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將貼壁生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞經(jīng)0.02%EDTA/0.25%胰酶（2∶1）混合液消化脫壁后按一定量接種至DMEM-H培養(yǎng)液（含10%FBS）中吹散均勻，移入新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，及時(shí)剔除污染、死亡的細(xì)胞，本次實(shí)驗(yàn)選用第四代細(xì)胞。

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、空白組、不同濃度陽性對(duì)照組、不同濃度藥物組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，用適量PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗培養(yǎng)瓶底壁后吸出丟棄，加入0.02%EDTA/0.25%胰酶1ml，混勻，于37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察約80%細(xì)胞變圓時(shí)加入DMEM-H（含10%FBS）培養(yǎng)液3ml，輕輕反復(fù)吹打沖洗培養(yǎng)瓶底壁，經(jīng)收集離心后用DMEM-H（含10%FBS）培養(yǎng)液調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為4×104個(gè)/ml。以每孔100μl接種96孔板，培養(yǎng)12h使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿底部，然后給以不同濃度藥物組各100μl，對(duì)照組加入100μl 20%乙醇（DMEM-H培養(yǎng)液稀釋，不含F(xiàn)BS），空白組則加入100μL DMEM-H培養(yǎng)液（含10%FBS），每組設(shè)3個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2孵化箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)12、24、36、48、72h后，取出，每孔加入5mg/ml MTT（由PBS配成5mg/ml濃度） 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，于低速搖床10min，靜置20min，于酶標(biāo)儀測(cè)490nm各孔吸光度OD值。

生長(zhǎng)抑制率（IR）=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

公式中藥物組為給予不同濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為不加藥物處理的對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，顯著性檢驗(yàn)用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物含量測(cè)定結(jié)果 通過HPLC法檢測(cè)得到兩種異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品與樣品HPLC分離色譜圖（圖1～4），根據(jù)兩種標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍配制樣品溶液濃度，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，每樣品3針。用外標(biāo)法計(jì)算并換算純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的平均含量為（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的異黃酮含量約為（8.07±0.09）%。

2.2 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)影響 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細(xì)胞12、24、36h后，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現(xiàn)出對(duì)MCF-7細(xì)胞穩(wěn)定的抑制作用，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨藥物濃度升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。在作用MCF-7細(xì)胞48h后，藥物組對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用出現(xiàn)反復(fù)，作用MCF-7細(xì)胞72h后抑制率反而整體上升。（圖5～6）（表1～2）。

2.3 兩種藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)影響的比較 根據(jù)2.2分析結(jié)果，采用純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物4個(gè)濃度（5、10、20、40mg/L）與同濃度陽性藥物大豆異黃酮在不同時(shí)段（12、24、36h）對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制率的研究，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足Mauchly球形假設(shè)（P>0.05），直接采用重復(fù)測(cè)量方差分析。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與大豆異黃酮組相比較，兩者對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用組間之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1.167，P=0.373）。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與對(duì)照組相比，兩者對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用組間之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.327，P=0.004）。即在上述濃度范圍，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物有與大豆異黃酮類似的作用，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有抑制作用（圖7）。

3 討論

乳腺癌的病因目前尚未定論，病因?qū)W研究顯示可能與遺傳、免疫、環(huán)境、飲食等因素有關(guān)，比較公認(rèn)且經(jīng)多年研究證實(shí)的，即為乳腺癌為一種雌激素依賴性腫瘤，內(nèi)源性雌激素水平持續(xù)升高或外源性雌激素大量補(bǔ)充，導(dǎo)致雌激素長(zhǎng)期暴露都會(huì)增加乳腺癌發(fā)生的概率[11]。植物雌激素類物質(zhì)是一類源于植物、活性與雌激素相似的雜環(huán)多酚類天然化合物，能與人體內(nèi)的雌激素受體（ER）結(jié)合從而引發(fā)雌激素效應(yīng)，但其結(jié)合率、效能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雌激素，但又占據(jù)雌激素受體，從而消減了雌激素長(zhǎng)期暴露作用，起到預(yù)防、治療乳腺癌的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的含量達(dá)（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，總異黃酮含量約為（8.07±0.09）% 。與其他類似文獻(xiàn)[12-13]所公布的自然發(fā)酵淡豆豉提取物異黃酮含量相比，純種發(fā)酵淡豆豉提取物所獲得的異黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他，說明純種發(fā)酵法與其他類方法相比，更加優(yōu)越，值得推廣。

在作用MCF-7細(xì)胞12、24、36h內(nèi)，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在5、10、20、40mg/L濃度對(duì)MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P<0.05），且其抑制作用與藥物濃度、作用時(shí)間呈正相關(guān)。淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細(xì)胞24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L（表1）。與大豆異黃酮組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用無明顯差異（P>0.05）），表明有效含量約8%的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物與有效含量約80%的大豆異黃酮具有相似的抑制作用，側(cè)面證明純種發(fā)酵淡豆豉所含異黃酮類活性成分較大豆異黃酮高。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮類物質(zhì)與MCF-7細(xì)胞接觸后，抑制效果立刻產(chǎn)生，則可能與持續(xù)占據(jù)ER導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞增殖能力下降有關(guān)。上述結(jié)果說明純種發(fā)酵淡豆豉具有明顯的抗乳腺癌的作用。

實(shí)驗(yàn)中藥物干預(yù)MCF-7細(xì)胞48h、72h后出現(xiàn)各藥物組抑制率不再呈類線性關(guān)系，而在72h后各組抑制率反而明顯抬升，并不能說明此時(shí)藥物對(duì)抑制率產(chǎn)生主導(dǎo)作用。MTT法檢細(xì)胞抑制率其本質(zhì)包括了增殖受限細(xì)胞和死亡細(xì)胞，在96孔板中培養(yǎng)48h、72h的細(xì)胞，其生長(zhǎng)環(huán)境不再適宜、營(yíng)養(yǎng)成分殆盡、代謝物積累、壞死細(xì)胞內(nèi)容物的釋放等都使細(xì)胞增殖受限，同時(shí)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此數(shù)據(jù)分析時(shí)，不采用48h、72h的數(shù)據(jù)。

綜上所述，純種發(fā)酵淡豆豉具有明確的抗乳腺癌的作用。其對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制作用與純種發(fā)酵淡豆豉濃度、作用時(shí)間呈正相關(guān)， 24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L。純種發(fā)酵淡豆豉發(fā)揮抗乳腺癌作用的機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2016.02.02）