龍眼和番石榴根際的短針中環(huán)線蟲鑒定

楊意伯　張紹升

摘 要 短針中環(huán)線蟲[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989]采自福建省龍眼樹和番石榴樹的根際土壤中。該線蟲的形態(tài)學(xué)鑒別特征為：唇盤橢圓形，輕微隆起，唇盤兩側(cè)的側(cè)器口明顯；亞中唇瓣4個(gè)，圓形、較發(fā)達(dá)且充分分離；唇區(qū)圓，無縊縮；唇環(huán)3個(gè)，第2環(huán)寬于第1環(huán)而窄于第3環(huán)；體環(huán)126～145個(gè)，后翻、后緣光滑，蟲體側(cè)區(qū)環(huán)紋愈合；口針長(zhǎng)54.3～66.7 μm；陰門張開，前陰唇無突起物；尾部漸細(xì)，末端鈍圓或裂葉狀。該線蟲rDNA-ITS和rDNA-D2D3區(qū)的序列大小分別為1 013和767～769 bp。短針中環(huán)線蟲為中國(guó)首次記錄，龍眼和番石榴為新發(fā)現(xiàn)的寄主植物。

關(guān)鍵詞 龍眼；番石榴；短針中環(huán)線蟲

中圖分類號(hào) S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989 was collected from the rhizosphere of Longan and Guava in Fujian. The morphological diagnostic characters of the nematode are as follows： labial plate oval， elevated slightly， including two distinct amphidial openings laterally； four sub median lobes round， well developed， separated from each other； lip region round， continuous with body， with 3 annules， first annule narrower than second and second narrower than third； body annules 126-145， retrorse， posterior margins smooth， several anastomoses present at lateral field； stylet 54.3-66.7 μm； vulva open， anterior vulval lip with no projection； tail tapering to a lobate or obtusely rounded tip. The nematode's rDNA-ITS and 28S rDNA-D2D3 region sequence was 1 013 and 767-769 bp， respectively. M. brevistylus was firstly reported in China， longan and guava were its new host.

Key words Longan； Guava； Mesocriconema brevistylus

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.020

環(huán)科（Ciconematidae）線蟲是一類具有環(huán)型食道、體環(huán)特征明顯的植物寄生線蟲。中環(huán)屬（Mesocriconema）線蟲外寄生于寄主根系，以口針不斷穿刺根組織造成傷口，為其他病原微生物的侵染創(chuàng)造了條件，使根系發(fā)育不良，致使寄主地上部過早衰退死亡，如異盤中環(huán)線蟲（M. xenoplax）是梨樹早衰病的主要原因之一[1]。中環(huán)線蟲的寄主范圍廣泛，可寄生茶、水稻、麻、煙草、棗、龍眼、柑橘、芭蕉、菠蘿、香蕉、咖啡、甘蔗、草果、草坪草等多種作物、果樹和草本植物[1-6]。中國(guó)報(bào)道的中環(huán)線蟲有15種[7-9]。目前關(guān)于龍眼和番石榴根部環(huán)線蟲的研究較少，龍眼和番石榴根部環(huán)線蟲種類尚不明確。近年來作者對(duì)熱帶果樹線蟲病進(jìn)行了調(diào)查，從龍眼和番石榴的果樹根際采集到1種中環(huán)線蟲，對(duì)該線蟲進(jìn)行了種的鑒定，現(xiàn)將結(jié)果作一報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 線蟲采集和分離

標(biāo)本采集：采自福州市金山的龍眼樹和漳州市南靖的番石榴樹的根際土壤。

線蟲樣本分離和固定：用漏斗法分離線蟲，線蟲經(jīng)溫?zé)釟⑺篮笥肨AF固定液固定[1]。

1.2 線蟲種類鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和顯微計(jì)測(cè) 利用光學(xué)顯微鏡對(duì)線蟲體形態(tài)、體環(huán)數(shù)目、內(nèi)部器官結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和顯微計(jì)測(cè)。計(jì)測(cè)采用de Man公式和符號(hào)：L（體長(zhǎng)），W（體寬），a（體長(zhǎng)/體寬），b（體長(zhǎng)/食道長(zhǎng)度），c（體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)），V（體前端至陰門的距離×100/體長(zhǎng)），VL（陰門至尾端的距離），VL/VB（陰門至尾端距離/陰部體寬），R（體環(huán)數(shù)），RB（蟲體中部的體環(huán)寬度），Rst（唇盤至口針基部之間的體環(huán)數(shù)），Roes（唇盤與賁門瓣之間的體環(huán)數(shù)），Rex（唇盤與排泄孔后第1環(huán)之間的體環(huán)數(shù)），Rv（陰門與尾端之間的體環(huán)數(shù)），Ran（肛門與尾端之間的體環(huán)數(shù)），Rvan（陰門與肛門之間的體環(huán)數(shù)），Stylet（口針長(zhǎng)度），Stylet cone（針錐長(zhǎng)度），m（針錐長(zhǎng)度/口針長(zhǎng)度），Oes.（食道長(zhǎng)度），Ex.P.（排泄孔至頭端距離），Tail（尾部長(zhǎng)度）。

利用掃描電子顯微鏡觀察線蟲體表環(huán)紋、唇部等外部結(jié)構(gòu)。采用戊二醛-鋨酸雙固定法[10]制備線蟲樣本，用CO2臨界點(diǎn)干燥法干燥線蟲。挑取線蟲至載物臺(tái)，噴金后觀察。

1.2.2 線蟲分子鑒定 DNA提取：采用文獻(xiàn)[11]的方法提取單條線蟲的DNA，所得DNA提取液直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

ITS區(qū)擴(kuò)增：采用通用引物[12]S-ITS1（5′-TTGA

TTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和p28S（5′-TTTCACTC

GCCGTTACTAAGG-3′）擴(kuò)增線蟲5.8S rDNA、18S rDNA及28S rDNA之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序與文獻(xiàn)[11]相同。

D2D3區(qū)擴(kuò)增：通用引物[13]D2A（5′-ACAAGTA

CCGTGAGGGAAAGTTG-3′）和D3B（5′-TCGGAAGG

AACCAGCTACTA-3′）被用于擴(kuò)增線蟲28S rDNA的D2D3區(qū)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序同上。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，回收目的片段，連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，通過藍(lán)白篩選3個(gè)陽性菌落測(cè)序。測(cè)序后將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，得到該序列與其他種類中環(huán)線蟲相應(yīng)序列的相似性。用軟件MEGA 6.0分析序列間同源性，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載中環(huán)屬與其他環(huán)科線蟲的ITS和D2D3區(qū)序列，以半穿刺屬線蟲（Tylenchulus spp.）作為外群，將序列導(dǎo)入軟件，對(duì)齊序列，分析方法選擇“鄰接法”，“Bootstrap”選擇1 000，計(jì)算完畢后生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)蟲體形態(tài)特征、顯微測(cè)量數(shù)據(jù)，及ITS區(qū)和D2D3區(qū)序列的比對(duì)結(jié)果，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定具體種類。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡的形態(tài)特征觀察及形態(tài)測(cè)量值，rDNA-ITS和28S rDNA-D2D3區(qū)序列分析結(jié)果，與相關(guān)參考文獻(xiàn)[14-15]比對(duì)，鑒定為短針中環(huán)線蟲[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera，1976）Loof & de Grisse，1989]（異名：Criconemoides brevistylus Singh & Khera，1976；Macroposthonia brevistylus（Singh & Khera，1976）Ebsary，1979；Criconemella brevistylus（Singh & Khera，1976）Luc & Raski，1981）。

2.1 測(cè)量數(shù)據(jù)（見表1）

2.2 形態(tài)描述

雌蟲：熱殺死后蟲體腹向彎曲呈“C”形（圖1-A）。體環(huán)126～145個(gè)，后翻，后緣光滑；蟲體側(cè)區(qū)環(huán)紋愈合，形成“Z”形結(jié)構(gòu)（圖1-E～F；圖2-E）。唇區(qū)圓，頂端平，無縊縮；唇環(huán)3個(gè)，第1環(huán)和第2環(huán)不后翻，第3環(huán)后翻，第2環(huán)寬于第1環(huán)而窄于第3環(huán)；唇盤輕微隆起，橢圓形，具4個(gè)大的亞中唇瓣，邊緣圓滑；側(cè)器口明顯，緊靠唇盤2側(cè)（圖1-C～D；圖2-B～C）。口針粗壯，基部球前緣凹陷；環(huán)線型食道，排泄孔位于后食道球前至峽部水平處（圖1-B）。陰門張開，前陰唇無突起物（圖1-G）。陰門后的蟲體漸細(xì)呈寬圓錐形，尾部末端鈍圓或裂葉狀（圖1-G；圖2-F～G）。

雄蟲未發(fā)現(xiàn)。

2.3 分子生物學(xué)特征

2.3.1 ITS區(qū)序列比對(duì) ITS擴(kuò)增片段約為1 100 bp（圖3），測(cè)序后長(zhǎng)度為1 013 bp（Genbank登錄號(hào)：KC937033）。與Genbank上已登錄的中環(huán)屬、環(huán)屬（Criconema）和擬鞘屬（Hemicriconemoides）線蟲的ITS序列的BLAST結(jié)果表明，M. brevistylus福州種群與南非種群（JQ231188）相似度最高，為99.6%；與中環(huán)屬其他線蟲M. xenoplax（FN433838，F(xiàn)N433849）、M. obtusicaudatus（JQ231190）和M. curvatum（HM116067）的相似度分別為95%、79%、79%和75%；與環(huán)科其他屬線蟲Criconema sphagni（JQ708133）和Hemicriconemoides spp.（EF126179、EU180057、EU664601、GQ354788和JQ911743）的相似度分別為80%和80%～83%。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明（圖4），M. brevistylus福州種群與中環(huán)屬線蟲親緣關(guān)系最近，以支持率81和94歸為同一聚類，與M. brevistylus南非種群同源性最高，以支持率100聚為1組。M. brevistylus福州種群與環(huán)科其他屬線蟲的同源性較低，以支持率38和41位于不同分支。

rDNA-D2D3擴(kuò)增片段約為900 bp（圖3），測(cè)序后長(zhǎng)度分別為767 bp（福州種群）和769 bp（漳州種群）（Genbank登錄號(hào)分別為KC538862和KC937033），這2個(gè)片段之間的序列相似度為99.4%。與Genbank上已登錄的中環(huán)屬、環(huán)屬、輪屬（Criconemoides）和擬鞘屬線蟲的D2D3序列的BLAST結(jié)果表明，M. brevistylus漳州種群與M. brevistylus南非種群（JQ231185）的相似度最高，為99.6%，與中環(huán)屬其他線蟲M. xenoplax（FN433856，F(xiàn)N433861）、M. obtusicaudatus（JQ231187）、M. solivagum（AY780969）和M. sphaerocephalum（AY780950）的相似度分別為87%～92%、90%、87%和81%，與M. ornatum（AY780968）的相似度高達(dá)97%，但比對(duì)基因覆蓋率只有70%；M. brevistylus與環(huán)科其他屬線蟲如Criconema mutabile（AY780954）、Criconemoides informis（AY780970）和Hemicriconemoides alexis（AY780959）的相似度分別為81%，83%和81%。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明（圖5），M. brevistylus福州、漳州種群與南非種群同源性最高，以支持率100聚為同一組；這3個(gè)種群與中環(huán)屬其他線蟲M. ornatum、M. xenoplax和M. solivagum親緣關(guān)系較近，以支持率91和70聚為一類，與屬內(nèi)M. obtusicaudatus和M. sphaerocephalum親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于不同分支；與環(huán)科其他屬線蟲的親緣關(guān)系則更遠(yuǎn)，位于不同聚類。

2.4 鑒別特征與近似種

鑒別特征：雌蟲體長(zhǎng)439.7～649.7 μm，體環(huán)126～145個(gè)，后翻，后緣光滑，蟲體側(cè)區(qū)環(huán)紋愈合；唇區(qū)圓，頂端平，無縊縮；唇環(huán)3個(gè)，第2環(huán)寬于第1環(huán)而窄于第3環(huán)；唇盤輕微隆起，橢圓形；亞中唇瓣4個(gè)，圓形、較發(fā)達(dá)且充分分離，側(cè)器口明顯，緊靠唇盤兩側(cè)；口針長(zhǎng)54.3～66.7 μm；受精囊不明顯，陰道直、前傾，陰門張開，前陰唇無突起物；陰門后的蟲體漸細(xì)呈寬圓錐形，尾端鈍圓或裂葉狀。

M. brevistylus的形態(tài)近似種有：方形中環(huán)線蟲（M. oblongatum）、阿普雷中環(huán)線蟲（M. apurense）和沼澤中環(huán)線蟲（M. palustre）[16-18]。這3種線蟲與M. brevistylus的區(qū)別是：體長(zhǎng)較短（分別為390～400，

380～450和290～490 vs 439.7～649.7 μm）；M. oblongatum的口針短（41.6～44.8 μm）；M. apurense的側(cè)區(qū)體環(huán)無愈合；M. palustre口針短（46～52 μm）、2個(gè)背亞中唇瓣和2個(gè)腹亞中唇瓣分別在唇區(qū)背、腹面相連。

3 討論與結(jié)論

短針中環(huán)線蟲福州、漳州種群的形態(tài)特征及測(cè)量值均與原始描述[14]相符，形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)特征與南非種群[15]相符。但是與原始描述相比，福州種群體環(huán)較少（126～145 vs 140～156），漳州種群體環(huán)較少（128～132 vs 140～156）而口針較長(zhǎng)（59.2～66.7 vs 56～60 μm），這2個(gè)種群雌蟲的陰門張開，而原始描述的線蟲墨線圖顯示陰門閉合。與南非種群相比，福州種群體環(huán)較少（126～145 vs 137～161），漳州種群體環(huán)較少（128～132 vs 137～161）、Rex略小（28～36 vs 34～43）、c值略?。?6.6～18.7 vs 18～27.5）和口針較長(zhǎng)（59.2～66.7 vs 54.5～61 μm）。福州種群與漳州種群的差異在于口針較長(zhǎng)（54.3～60.7 vs 59.2～66.7 μm）和Rex略?。?3～37 vs 28～36），上述這些差異可能是種群地理分布不同和寄主不同引起的。

據(jù)國(guó)外報(bào)道龍眼根際的中環(huán)線蟲為圓頭中環(huán)線蟲（M. sphaerocephalum）[18]，番石榴根際有多種中環(huán)線蟲（Mesocriconema spp.）[18-20]。國(guó)內(nèi)龍眼和番石榴根際的中環(huán)線蟲尚未見報(bào)道。福建省其他作物根際的中環(huán)線蟲種類有：裝飾中環(huán)線蟲（M. ornatum）、彎曲中環(huán)線蟲（M. curvatum）和異盤中環(huán)線蟲（M. xenoplax）[2-3]。M. brevistylus福州種群和漳州種群的唇盤輕微隆起，體環(huán)126～145個(gè)，前陰唇無突起物，這些特征與上述3種中環(huán)線蟲都有顯著區(qū)別：M. ornatum的體環(huán)96～106個(gè)，前陰唇有2個(gè)穗狀突起；M. curvatum的體環(huán)84～95個(gè)；M. xenoplax的唇盤明顯隆起，體環(huán)82～90個(gè)。

據(jù)報(bào)道短針中環(huán)線蟲分布于印度的蔬菜和南非的草坪草[14-15]。短針中環(huán)線蟲為中國(guó)首次記錄，龍眼和番石榴為新發(fā)現(xiàn)寄主植物。目前Genbank有該線蟲南非種群的ITS和D2D3區(qū)序列數(shù)據(jù)，國(guó)內(nèi)首次登錄該線蟲的ITS和D2D3區(qū)序列。

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