雙波長法測定木薯的直鏈和支鏈淀粉含量

郭運(yùn)玲　孔華　左嬌　賈瑞宗　黃啟星　郭靜遠(yuǎn)　周霞　郭安平

摘 要 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量及其比例是木薯淀粉品質(zhì)的重要指標(biāo)。采用雙波長法對30個(gè)木薯株系的直、支鏈淀粉的含量進(jìn)行了測定，根據(jù)碘分別與直鏈和支鏈淀粉反應(yīng)生成復(fù)合物的吸收光譜，我們最后確定了直鏈淀粉的和支鏈淀粉的參比波長和測定波長分別是609和469.5 nm、542和721 nm。根據(jù)回歸方程得到了30個(gè)木薯株系的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。本實(shí)驗(yàn)中用于測定木薯的直鏈淀粉濃度在0～26 μg/mL，支鏈淀粉濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)符合比耳定律。結(jié)果表明： SC8不同株系的直鏈淀粉含量變化范圍：14.879%～21.905%，支鏈淀粉含量變化范圍：47.864%～56.955%；SC6不同株系的直鏈淀粉含量變化范圍：15.494%～24.726%，支鏈淀粉含量變化范圍44.292%～57.465%。該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、效率高，工作量小，適于批量木薯樣品分析。

關(guān)鍵詞 木薯；雙波長法；直鏈淀粉；支鏈淀粉；

中圖分類號 TS235.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The content and proportion of amylose and amylopectin are important indices of cassava. A dual-wavelength method was applied to the determination of amylose and amylopectin in 30 cassava varieties. According to the absorption spectra of the two complexes， the determination of wavelength and reference wavelength of amylose， 609 nm and 469.5 nm， and the determination of wavelength and reference wavelength of amylopectin， 542 nm and 721 nm， were selected as the measuring wavelength. The content of amylose and amylopectin were figured out from the two regressive equations. Beer′s law was obeyed in 0-26 μg/mL for amylose and 0-100 μg/mL for amylopectin. The results showed that the amylose content of SC8 different strains was 14.879% to 21.905%， the amylopectin content was 47.864% to 59.955%； The amylose content of SC6 different strains was 15.494% to 24.726%， and the amylopectin content was 44.292% to 57.465%. The method had a good repetition and could be applied for analyzing plentiful samples of cassava due to its accuracy and rapidness.

Key words Cassava；Dual-Wavelength method；Amylose；Amylopectin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.027

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科塊根作物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，木薯是主要以地下塊根形式儲存合成的淀粉，木薯適應(yīng)范圍非常廣，具有抗逆、耐貧瘠，以及生物量很高和淀粉含量高等多種特點(diǎn)。木薯淀粉在淀粉食品、工業(yè)原料等領(lǐng)域有十分廣泛的用途，在中國木薯作為新興的能源作物受到重視，木薯生產(chǎn)和加工產(chǎn)業(yè)有很大的發(fā)展前景[1]。木薯淀粉的主要成份是直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉和支鏈淀粉的組成比例直接影響著淀粉的化學(xué)特性以及加工用途[2]。測定淀粉含量及淀粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉組成比例的方法有很多，如碘親和力測定法、排阻色譜分析法、旋光法、國標(biāo)法、雙波長法和多波長法、比色法、近紅外法、差示掃描量熱法等。這些測定方法各有自己的特點(diǎn)和不足，如有的操作過程復(fù)雜，成本較高，或者不能很好把直鏈和支鏈淀粉區(qū)分開來，因此應(yīng)用有一定的局限性[3-6]。淀粉的雙波長測定方法主要是根據(jù)碘分別與直鏈淀粉和支鏈淀粉發(fā)生反應(yīng)所生成的復(fù)合物顏色對吸收光譜的反應(yīng)，直鏈淀粉與碘試劑發(fā)生反應(yīng)生成深藍(lán)色的復(fù)合物，而支鏈淀粉與碘試劑發(fā)生反應(yīng)生成棕紅色復(fù)合物，它們的吸收光譜不同。本課題組通過直鏈淀粉/支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過碘試劑處理后所發(fā)生的反應(yīng)，通過液相色譜掃描獲得各自的吸收光譜，然后運(yùn)用作圖方法找到適合測定直鏈淀粉與支鏈淀粉的2種波長，并建立它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于本方法具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、效率高，工作量小，成本低等特點(diǎn)，已成為植物淀粉測定的常用方法[7-14]。在木薯直鏈/支鏈淀粉測定中，黃惠芳等[15]利用該方法對木薯GR891品種的直鏈和直鏈淀粉測定過程中樣品處理溫度進(jìn)行了研究。因此本研究采用該方法對30份木薯樣品進(jìn)行直鏈和支鏈淀粉的的測定，獲得了30份木薯樣品的直鏈/支鏈淀粉的含量，從而得到每個(gè)木薯樣品的總淀粉含量。

RNA干擾技術(shù)和反義技術(shù)是人為控制基因表達(dá)的直接有效方法，已經(jīng)成為人們在基因工程技術(shù)中使用的有效手段和工具[16]，在水稻、玉米和馬鈴薯等農(nóng)作物上利用該手段改變淀粉組成等都有成功的報(bào)道[17-19]。本研究中所測定的30份木薯材料中，除了2個(gè)對照親本外，28份是利用RNA干擾技術(shù)和反義技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株，因此本試驗(yàn)采用雙波長比色法對所獲得的28個(gè)轉(zhuǎn)基因植株及2個(gè)對照親本（SC6和SC8）淀粉含量和直鏈/支鏈淀粉含量進(jìn)行測定，比較淀粉組分是否發(fā)生變化，從而比較RNA干擾技術(shù)和反義技術(shù)在改良木薯淀粉品質(zhì)上的效果，同時(shí)為木薯產(chǎn)品加工及木薯淀粉品質(zhì)的遺傳改良及生理指標(biāo)分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯塊根 木薯塊根采自種植于海南省文昌市農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物及植物用微生物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（海口）試驗(yàn)基地的28個(gè)木薯轉(zhuǎn)基因株系及2個(gè)對照親本材料（SC6和SC8）。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，供試材料統(tǒng)一時(shí)間種植在相同地塊，栽培管理措施相同。在木薯成熟期鮮薯采后洗干凈切片（絲），105 ℃烘箱烘干至恒重，將木薯干（絲）粉碎后經(jīng)過100目篩，然后用石油醚進(jìn)行脫脂，再在80 ℃烘箱中烘干至恒重，脫脂后的木薯干粉用于淀粉含量和淀粉組分的測定分析。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用儀器 美國PerkinElmer公司生產(chǎn)的Lambda35紫外-可見分光光度計(jì)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（國產(chǎn)）、粉碎機(jī)（美的牌）、索氏抽提器、江蘇金壇市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋、電子分析天平。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)所需試劑 直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品由美國sigma公司生產(chǎn)，氫氧化鉀、鹽酸、無水乙醇、石油醚、碘和碘化鉀均為國產(chǎn)分析純。

碘試劑：先稱取碘化鉀2.0 g，用少量蒸餾水溶解后再加入碘0.2 g，待碘完全溶解后用蒸餾水稀釋定容至100 mL貯藏于棕色磨口試劑瓶中。碘試劑一般現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

30份木薯塊根干粉中總淀粉含量和直鏈淀粉/支鏈淀粉組成比例的測定方法主要參考戴雙等[8]的方法。

1.2.1 直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取購于sigma公司的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品0.100 0 g，將它加入100 mL容量瓶中，參考戴雙等[8]的方法配制1 mg/L直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后配制濃度分別為0、2、6、10、14、18、22、26 μg/mL的系列直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述同樣的方法配制濃度分別為0、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉測定波長的選擇 先分別選取直鏈淀粉的26 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和支鏈淀粉的100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將它們分別在分光光度計(jì)上進(jìn)行400～1 000 nm的波段光譜掃描，獲得直鏈/支鏈淀粉的吸收光譜圖，然后采用作圖方法獲得了木薯直鏈淀粉測定波長為λ1值為609 nm，它的參比波長λ2值為469.5 nm；木薯支鏈淀粉的測定波長λ3值為542 nm，它的參比波長λ4值為721 nm。

1.2.3 雙波長木薯淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 （1）雙波長木薯直鏈淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：參考戴雙等[8]的方法，將配制好的用于測定木薯直鏈淀粉的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在λ1值為609 nm和λ2值為469.5 nm的雙波長下分別測定得到它們的吸光度為Eλ1、Eλ2，吸光度差值△E=Eλ1-Eλ2。然后以吸光度差值△E值為橫坐標(biāo)，以直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，繪制即得到雙波長木薯直鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）雙波長木薯支鏈淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。同樣參考戴雙等[8]的方法，將配制好的用于測定木薯支鏈淀粉的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在λ3值為542 nm和λ4值為721 nm 2個(gè)波長下分別測定得到它們吸光度Eλ3、Eλ4，吸光度差值△E=Eλ3-Eλ4。然后以吸光度差值△E為橫坐標(biāo)，以支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，繪制即可得到雙波長木薯支鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

木薯樣品總淀粉含量即為木薯直鏈淀粉的含量與木薯支鏈淀粉含量之和。

1.2.4 雙波長比色法測定木薯塊根中淀粉的含量 分別稱取30份經(jīng)過脫脂處理的木薯淀粉樣品各0.100 g左右，先加入適量的無水乙醇濕潤透，然后加入10 mL濃度為 1 mol/L氫氧化鉀溶液，再放入75 ℃熱水浴中振蕩15 min，待完全溶解后取出，稍冷卻后加入蒸餾水定容至50 mL，靜置20 min。分別吸取3 mL木薯樣品溶液作為木薯樣品的測定液和樣品空白液，然后各加入20～30 mL蒸餾水，以0.1 mol/L濃度鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.5左右，在木薯樣品測定液中加入0.5 mL碘試劑，將木薯樣品的測定液和樣品空白液定容至50 mL，搖勻后靜置20 min，再以樣品空白液作為對照，分別對30份木薯樣品的測定液用分光光度計(jì)在λ1值為609 nm、λ2值為469.5 nm、和λ3值為542 nm、λ4值為721 nm這4個(gè)波長下測定得吸光度，再根據(jù)木薯樣品的直鏈淀粉和支鏈淀粉的雙波長測定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出木薯樣品的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，直鏈淀粉和支鏈淀粉二者相加即可得到木薯樣品總淀粉的含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯直鏈淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以木薯直鏈淀粉的測定波長為λ1值609 nm，參比波長為λ2值469.5 nm的吸光度差值△E值為橫坐標(biāo)，以直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，繪制得到了木薯直鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），擬合方程式為：y=244.3x-1.636，R2=0.996，說明用于木薯直鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作良好，直鏈淀粉質(zhì)量濃度在26 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合比耳定律。

2.2 木薯支鏈淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以木薯支鏈淀粉的測定波長λ3值為542 nm，參比波長λ4值為721 nm的吸光度差值△E值為橫坐標(biāo)，以支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，繪制得到了木薯支鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），擬合方程式為：y=506.4x+3.968，R2=0.999。也說明了用于木薯支鏈淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作良好，支鏈淀粉質(zhì)量濃度在100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，符合比耳定律。

2.3 華南木薯SC8及15個(gè)轉(zhuǎn)基因木薯樣品的直鏈、支鏈及總淀粉含量測定

從表1中可以看出，對照親本SC8直鏈淀粉含量為17.354%，支鏈鏈淀粉含量55.563%，總淀粉含量72.917%，15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，直鏈淀粉含量變化范圍：14.879%～21.905%，支鏈淀粉含量變化范圍：47.864%～56.955%，支鏈/直鏈比變化范圍：2.460～3.906。其中8（2S）15直鏈淀粉含量為21.905%，比對照SC8高26.22%。15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，有8個(gè)直鏈淀粉含量比對照有所提高，其中有2個(gè)的差異達(dá)到顯著水平，說明轉(zhuǎn)入的淀粉分支酶干擾載體對木薯支鏈淀粉合成起了一定的干擾作用，從而提高了直鏈淀粉的含量。

2.4 SC6及13個(gè)轉(zhuǎn)基因木薯株系樣品的直鏈、支鏈及總淀粉含量測定

從表2中可以看出，對照親本SC6直鏈淀粉含量為16.779%，支鏈淀粉含量57.465%，總淀粉含量74.244%，13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，直鏈淀粉含量變化范圍：15.494%～24.726%，支鏈淀粉含量變化范圍44.292%～57.465%，支鏈/直鏈比變化范圍：1.969～3.384。其中6J9（8）直鏈淀粉含量為24.726%，與SC6相比較提高了47.36%；6（2S）6直鏈淀粉含量23.401%，與對照親本SC6相比較提高了39.47%。13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，有8個(gè)直鏈淀粉含量比對照高，其中有3個(gè)的差異達(dá)到顯著水平。說明轉(zhuǎn)入的淀粉分支酶干擾和反義載體基因?qū)δ臼碇ф湹矸酆铣善鹆艘欢ㄒ种谱饔?，從而提高了直鏈淀粉的含量?/p>

3 討論

3.1 木薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的確定和測定波長選擇

本實(shí)驗(yàn)中選擇了木薯直鏈淀粉測定的最大的標(biāo)準(zhǔn)溶液為26 μg/mL， 木薯支鏈淀粉測定的最大的標(biāo)準(zhǔn)溶液為100 μg/mL。跟已有文獻(xiàn)報(bào)道相同[7，9-13]。對標(biāo)準(zhǔn)溶液在分光光度計(jì)上進(jìn)行400～1 000 nm光譜段掃描，分別獲得木薯直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸收光譜圖，再用作圖方法獲得木薯直鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為609和469.5 nm，木薯支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為542和721 nm。直鏈淀粉和支鏈淀粉分別在609和542 nm處有最大吸收峰。本實(shí)驗(yàn)采用的直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品為美國sigma公司生產(chǎn)，標(biāo)準(zhǔn)品不同，尤其是純度不同，獲得的測定波長會有差異。加列西·馬那甫等[13]對淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉測定分析，他們采用的作圖方法確定了谷物類和豆類淀粉的直鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為565和495 nm，支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為530和654 nm。金玉紅等[9]在測定小麥的直鏈和支鏈淀粉中采用的擇直鏈淀粉的測定波長為631和480 nm，支鏈淀粉的測定波長為554和754 nm。前人對高梁及多種糧豆作物做了測定，樣品不同測試結(jié)果會有很大的差異[7，10-12]。大米直鏈淀粉測定有國標(biāo)GB/T15683-2008[20]，該方法采用單波長720 nm處的吸光度，對大米等谷物類淀粉的測定比較有效，而對于木薯等塊根類淀粉，采用雙波長測定方法更有效。

3.2 木薯直鏈淀粉和支鏈淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本實(shí)驗(yàn)中直鏈淀粉的濃度在0～26 μg/mL，支鏈淀粉濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合比耳定律。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在小麥、高粱等禾谷類作物以及煙草、豆類、銀杏等方面研究表明，直鏈淀粉濃度一般在0～80 mg/L，支鏈淀粉的濃度在0～400 mg/L范圍內(nèi)符合比耳定律[7，9-13]。利用該方法測定直鏈和支鏈淀粉，不同作物標(biāo)準(zhǔn)曲線會有差異，但是只要符合比耳定律，都是有效的。

3.3 木薯樣品淀粉組分的測定

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法對木薯淀粉樣品的測定重復(fù)性好，因此是準(zhǔn)確有效的。淀粉中一般直鏈淀粉含量在25%左右，支鏈淀粉含量在75%左右。古碧等[2]采用單波長法，在620 nm處對79份木薯品種（系）的直鏈和支鏈進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，直鏈淀粉含量在15.52%～25.02%，支鏈淀粉74.98%～84.48%。其中SC6直鏈淀粉含量20.06%，直鏈淀粉79.94%，SC8直鏈淀粉含量18.27%，直鏈淀粉81.73%。本實(shí)驗(yàn)中SC6不同轉(zhuǎn)基因株系直鏈淀粉含量15.494%～24.726%，支鏈淀粉含量變化范圍44.292%～57.465%，SC8不同轉(zhuǎn)基因株系的直鏈淀粉含量變化范圍：14.879%～21.905%，支鏈淀粉含量變化范圍：47.864%～56.955%。折算成百分百的含量則是：SC6不同轉(zhuǎn)基因株系直鏈淀粉含量22.600%～33.681%，支鏈淀粉含量為67.854%～77.400%， SC6直鏈淀粉含量為22.600%； SC8不同轉(zhuǎn)基因株系直鏈淀粉含量為23.800%～30.906%，支鏈淀粉含量為69.094%～76.200%，SC8直鏈淀粉含量為23.800%。測定方法不同，樣品取樣時(shí)間和栽培地點(diǎn)不同，管理方法不同，測定結(jié)果會有差異。因此，在取樣時(shí)最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定木薯樣品的收獲時(shí)間。尤其是在試驗(yàn)開始設(shè)計(jì)時(shí)就要綜合考慮這些影響因素。本研究是在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上確定雙波長法測定木薯淀粉組分，從結(jié)果和重復(fù)性及操作上來看，該方法是有效的。是否有更有效的測定方法有待下一步做全面系統(tǒng)的測定方法比較實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)論

采用雙波長比色方法對30份木薯不同株系的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量進(jìn)行了測定，根據(jù)碘分別與直鏈淀粉和支鏈淀粉反應(yīng)生成的復(fù)合物吸收光譜的不同，確定了30份木薯的直鏈淀粉和支鏈淀粉參比波長和測定波長分別為609和469.5 nm，542和721 nm。根據(jù)回歸方程得到了30份木薯不同株系的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。本實(shí)驗(yàn)中木薯的直鏈淀粉的濃度在0～26 μg/mL，支鏈淀粉濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)符合比耳定律，由回歸方程計(jì)算得到了木薯直鏈和支鏈淀粉含量。16份木薯SC8不同株系的直鏈淀粉含量變化范圍：14.879%～21.905%，支鏈淀粉含量變化范圍：47.864%～56.955%；14份木薯SC6不同株系的直鏈淀粉含量變化范圍：15.494%～24.726%，支鏈淀粉含量變化范圍：44.292%～57.465%。

致謝 感謝賴丁王、徐林在標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備和淀粉組分測定中做的大量工作。

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