植物氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究進展

彭波　孫艷芳　龐瑞華　宋曉華　李慧龍　周棋贏　袁紅雨　宋世枝

摘 要 氨基酸對植物的生長與發(fā)育必不可少，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在植物體內(nèi)各種氨基酸的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮極其重要的作用。目前已經(jīng)鑒定了多種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，并且許多重要的植物基因組序列已經(jīng)完成了拼接和組裝工作，但人們對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的功能與調(diào)節(jié)還知之甚少。本文綜述了植物氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的進化、表達、功能及調(diào)控方面的新進展，以期為主要糧食作物的遺傳改良提供借鑒與參考。

關(guān)鍵詞 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白；進化；表達；功能；調(diào)控

中圖分類號 Q94-3 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Amino acid transporters have essential roles in the transport of a broad range of amino acids， which are indispensable in plant growth and development. While many putative amino acid transporters have been identified and the complete genomic sequences of the important plants have already been completed by splicing and assembling， there is still little known about the regulation of amino acid transporter function. This study mainly reviewed the evolution， expression， function and regulation of amino acid transporters in plants. This review would provide useful references for staple food crops in plants.

Key words Amino acid transporter；Evolution；Expression；Function；Regulation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.031

氨基酸在植物的生長、發(fā)育和代謝過程中發(fā)揮重要的作用，這是因為氨基酸是植物體內(nèi)各種酶和蛋白質(zhì)合成的基本元件，并且氨基酸是植物體內(nèi)核酸、葉綠體、激素和次生代謝等物質(zhì)的前體或者氮素的來源，而這些物質(zhì)是植物的生長和發(fā)育所必需的物質(zhì)。植物的根或葉片組織細胞內(nèi)的質(zhì)體、細胞質(zhì)、線粒體以及過氧化物酶體都可以合成氨基酸[1]，植物還可以直接從土壤中吸收氨基酸或者將無機氮最終轉(zhuǎn)化為氨基酸[2]。在植物體內(nèi)合成或者從體外吸收的氨基酸有的立即被代謝、有的經(jīng)過短暫存儲或者通過韌皮部轉(zhuǎn)運到正在生長的部位或者植物的庫器官[3-4]，在這些過程中氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（Amino acid transporters， AATs）是必不可少的。大量研究結(jié)果還表明，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白是植物代謝過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子[3-9]，對植物的生長和發(fā)育起十分重要的作用。

在過去的十幾年里，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在植物領(lǐng)域的研究取得了巨大進步[3，9]，研究對象由原來以擬南芥為主逐漸發(fā)展到以重要糧食作物為主，越來越多的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因在作物中被分離、克隆以及功能分析[9-10]。因此本文綜述了氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在植物研究中的新進展，包括氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的進化、表達、調(diào)控與功能等方面的研究結(jié)果，以期為氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在植物特別是重要糧食作物中的深入研究提供參考。

1 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的進化研究

氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白不僅存在于植物中，在細菌、真菌、酵母和動物中也發(fā)現(xiàn)了許多氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。研究表明在動物、植物和真菌中氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白相對比較保守[3，11]。氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因至少有5大基因家族，如氨基酸-多胺-膽堿（Amino acid-polyamine-choline，APC）超基因家族、二羧酸鈉同向轉(zhuǎn)移（Sodium-dicarboxylate symporter， SDS）超基因家族、神經(jīng)傳遞素（Neurotransmitter superfamily，NTS）超基因家族、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白超家族1（Amino acid transporter superfamily 1， ATF1）和主要促進因子家族內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白超家族（Amino acid transporters within the major facilitator superfamily，MFS）[6]。在植物中，APC轉(zhuǎn)運蛋白超家族中包含兩個基因家族：氨基酸/生長素透性酶家族（Amino acid/auxin permease， AAAP）和APC家族（APC family）。而AAAP包括氨基酸透性酶（Amino acid permeases，AAPs）、類似賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（Lysine-histidine-like transporters，LHTs）、脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（Proline transporters，ProTs）、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白（γ-aminobutyric acid transporters，GATs）、類似ANT1的芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（ANT1-like aromatic，and neutral amino acid transporters）、生長素轉(zhuǎn)運蛋白（Auxin transporters，AUXs）[1，6，8，11]。APC家族在植物中包括陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（Cationic amino acid transporters，CATs）、氨基酸/多胺轉(zhuǎn)運蛋白（Amino acid/choline transporters， ACTs）和多胺氫離子同向轉(zhuǎn)運蛋白（Polyamine H+-symporters， PHSs）[8，12-13]。

在擬南芥中，目前已經(jīng)鑒定到超過60種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，其中研究最深入的是AAP和LHT，包括它們的特異的底物、基因定位和生物學(xué)功能等方面的研究較系統(tǒng)[2-3，8]。在擬南芥中AAP家族一共有8個成員（AtAAP1-AtAAP8），而賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族（LHTs）有10個成員（AtLHT1-10），其中AtLHT1最早被發(fā)現(xiàn)，它主要參與氨基酸的選擇性運輸[14-18]。從進化的角度來分析LHTs和AAPs兩大家族的蛋白發(fā)現(xiàn)，在植物界中LHTs家族的蛋白在綠藻中最先出現(xiàn)[3，19-23]，相對AAPs大家族的蛋白來說比較原始，但是進一步研究發(fā)現(xiàn)LHT和AAP兩大家族的蛋白明顯不同，這暗示著LHT和AAP兩大家族的蛋白成員在功能及其調(diào)控方面可能存在差異。

目前關(guān)于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在水稻中的研究較少。將水稻中所有可能存在的85個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)它們在水稻的12條染色體上都有分布，而大部分氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白屬于AAAP超家族，也有一部分屬于APC超家族，其中有很多結(jié)構(gòu)域在不同的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白中都相對比較保守[8]。在這85個基因中有47個基因在進化過程中發(fā)生復(fù)制事件，存在單獨復(fù)制，也有串聯(lián)重復(fù)的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白[8]。Lu等[10]對水稻的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族進行了深入研究，79個已發(fā)現(xiàn)的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因分別分布在水稻的11條染色體上（除了第9染色體上）。根據(jù)其全長蛋白質(zhì)序列進行聚類分析，揭示水稻中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白可以分為A、B、C和D 4個亞族，分別包括8、28、15和28個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。隨著水稻中氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白研究的逐漸深入，相信在其它重要糧食作物（如小麥、玉米）中會有越來越多的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白被發(fā)掘、克隆乃至功能的解析。

2 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達研究

在研究基因功能的時候經(jīng)常會用到基因敲除或者抑制基因的表達等策略，但是在對擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白功能的研究時，這些突變體并不一定能夠產(chǎn)生預(yù)期的效果。例如：在相同的生長條件下，AtAAP3的T-DNA插入突變體和野生型并沒有明顯的差異；還有AtAAP1的RNAi突變體的表型也和正常對照的擬南芥一樣[4，24]。AtAAP2、AtAAP5和AtAAP6能夠在擬南芥的根中與AtAAP3共表達，并且這三個基因編碼的氨基酸透性酶與AtAAP3在擬南芥體內(nèi)運輸相似的氨基酸。因此，AtAAP2、AtAAP5和AtAAP6或許可以在某種程度上互補AtAAP3的功能[4]。與之相類似的是AtAAP5主要在原葉、花和種子中表達，這種表達模式與AtAAP1很類似，可能AtAAP5能夠互補AtAAP1的功能而導(dǎo)致AtAAP1的突變體中表型無明顯改變。

對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達研究主要是利用RT-PCR、qRT-PCR、啟動子融合GUS基因表達、原位雜交、亞細胞定位、免疫組化和啟動子融合GFP蛋白等策略[4，9，25]。AtAAP2、AtAAP4和AtAAP5這3個基因主要在原葉、莖和花中表達；AtAAP1在擬南芥的種子中表達；AtAAP2在擬南芥的長角果、葉片、莖、花梗和成熟植株的微管組織中表達，它可能在氨基酸的長距離轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮重要的作用[25-28]。AtAAP3主要在根的微管組織中表達，也觀察到它在雄蕊裂開前在結(jié)締組織中短暫表達[24]。AtAAP6主要在根和葉中表達，也觀察到它在木質(zhì)部的薄壁組織中表達。因為AtAAP6對酸性和中性氨基酸有很強的親和力，并且氨基酸在木質(zhì)部中的含量很低，這暗示著AtAAP3可能在從木質(zhì)部吸收氨基酸的過程中起很重要的作用[26，29-30]。AtAAP8在幼小的長角果和發(fā)育的種子表達，因此它和AtAAP1一樣可能參與氨基酸向種子中轉(zhuǎn)運的過程[3，31]。AtLHT1基因發(fā)現(xiàn)在根的表面和花粉中表達，它可能參與根從土壤中吸收氨基酸的過程，或者參與氨基酸向庫器官運輸?shù)倪^程[14]。AtLHT2基因?qū)Ω彼岷吞於彼岬挠H和力很強，并在擬南芥的絨粘層特異表達，這意味著AtLHT2基因可能參與氨基酸向孢子細胞的運輸[15]。在擬南芥中，關(guān)于其它的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白也進行了相關(guān)的研究[4，32-34]，如AtProT1、AtProT2、AtProT3、AtANT1和APC超家族中的成員，但是它們在擬南芥的生長、發(fā)育過程的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待進一步研究。

近來，對水稻中氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族中的成員用3種數(shù)據(jù)庫和qRT-PCR的方法進行了全面表達分析[8]。用水稻的EST數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene/）發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因在水稻中是表達的，并且許多基因在莖、根、葉、幼穗和種子中表達水平相對較高，也有一些水稻中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因是特異表達的，如OsBAT5在種子中特異表達；OsBAT4在莖中特異表達；OsLHT2，OsATL10和OsLAT5在水稻的花中特異表達等；利用水稻的芯片表達數(shù)據(jù)庫（http：//signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）發(fā)現(xiàn)不同的基因往往具有不同的表達模式，進而可以把水稻中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因分為6大組；根據(jù)大規(guī)模平行信號測序標(biāo)簽（Massively parallel signature sequencing tags， http：//mpss.udel.edu/rice/）也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因在水稻中是表達的，其大部分基因的表達水平較低，只有三個基因的表達較強（OsAUX1、OsATL5和OsATL15）[8]。將水稻進行氮肥饑餓處理后再檢測其氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因具有不同的表達模式，暗示著它們可能在氮肥的吸收與分布方面發(fā)揮及其重要的功能[10]。通過比較水稻與擬南芥中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達模式發(fā)現(xiàn)，有26個基因在水稻和擬南芥中具有相似的表達模式，同源基因的相關(guān)系數(shù)介于0.7～0.9之間，并且它們的進化關(guān)系非常密切[8]。以上這些研究結(jié)果為今后水稻體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達分析、亞細胞定位、功能解析、調(diào)控機制等方面的研究提供極其重要的信息。

3 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控研究

目前，關(guān)于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達調(diào)控方面的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，還沒有試驗證據(jù)支持植物中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或者是受轉(zhuǎn)錄后修飾控制的。有大量的試驗數(shù)據(jù)表明氨基酸的轉(zhuǎn)運是受環(huán)境信號調(diào)控的，如光、水、鹽脅迫和營養(yǎng)物質(zhì)等[2-4，35-41]。當(dāng)用水或者鹽脅迫處理一些植物時，脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因出現(xiàn)上調(diào)表達，如擬南芥的AtProT2基因、大麥的HvProT基因和冰葉日中花的McAAT1基因[32，38，41]。在擬南芥中用水或者鹽脅迫處理時，AtAAT6基因和AtAAT4基因的表達量降低[32]。當(dāng)冰葉日中花（一種耐鹽植物）的根尖和成熟根的表皮處于滲透脅迫的時候，McAAT2基因被誘導(dǎo)表達[41]。研究發(fā)現(xiàn)水稻中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因在非生物脅迫（干旱、鹽或者冷）處理時，有21個基因存在明顯的上調(diào)或者下調(diào)表達[8]。在干旱、鹽或者冷脅迫處理水稻時，OsAAP15、OsATL6和OsANT3基因都會上調(diào)表達；在干旱和鹽脅迫處理時，OsATL13、OsAAP6、OsAAP11、OsAAP13和OsAAP5基因也上調(diào)表達；在干旱脅迫處理時，OsGAT2和OsCAT6兩個基因上調(diào)表達；在鹽脅迫處理時，OsANT4、OsBAT7和OsATL11三個基因上調(diào)表達[8]。OsAUX1、OsAAP4、OsBAT4和OsAAP8這四個基因在干旱、鹽或者冷脅迫處理水稻時都會下調(diào)表達，暗示它們在非生物脅迫過程中可能發(fā)揮重要的作用。

比較有意思的是在擬南芥中，病原菌的襲擊可能影響到氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達。如在擬南芥中AtLHT1基因在有病原菌襲擊的情況下上調(diào)表達，這可能使胞漿中的谷氨酰胺的含量升高，進而影響到水楊酸信號傳導(dǎo)途徑最終導(dǎo)致擬南芥的抗病性減弱[42]。同樣，在百脈根（豆科模式植物）中菌根上的真菌可以誘導(dǎo)LjLHT1基因在根中表達。并且發(fā)現(xiàn)植物的營養(yǎng)條件（不論是有機氮肥還是無機氮肥）改變時，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達都會受到一定程度的影響[3，32，35]。當(dāng)植物發(fā)生突變或者超量表達的時候，氨基酸轉(zhuǎn)運過程也隨之發(fā)生改變；細胞發(fā)生衰老凋亡的時候其氨基酸水平也會發(fā)生變化[43-47]，這些過程都會或多或少的影響特異氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達。

氨基酸不但對于合成蛋白質(zhì)或者各種酶非常重要，而且是許多關(guān)鍵的化合物（植物激素和信號分子等）的前體物質(zhì)，如一些化合物對生物的生長、發(fā)育、代謝和防御過程起著十分重要的作用。那么各種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在“源”與“庫”之間氨基酸運輸這個復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位[48-54]。在植物中氮轉(zhuǎn)運蛋白的活性對各種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白上游或者下游的物質(zhì)都產(chǎn)生重要的影響，而“庫”的發(fā)育（小花數(shù)、長角果、種子或者粒重）和植物種子的代謝又受各種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的調(diào)控[44，46-47]。在植物中如果氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)生突變或者超量表達，一些氨基酸可能作為信號分子引起一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)反應(yīng)進而改變基因的表達，最終導(dǎo)致表型發(fā)生變化[56-57]，這當(dāng)中的何種氨基酸可以作為信號分子？信號分子又是如何傳遞的[3，58-61]？在植物中是不是存在像酵母中的氨基酸透性酶（Ss1和Gap1）和激酶（GCN2激酶）等問題還有待進一步的研究。

4 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的功能研究

氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的克隆與功能分析在擬南芥中的研究最為深入，在AAP家族的8個成員（AtAAP1-AtAAP8）中，AtAAP3和AtAAP5蛋白可以轉(zhuǎn)運酸性、中性和堿性氨基酸，而別的6個成員一般可以轉(zhuǎn)運中性和酸性氨基酸[1，18，30]。到目前為止所有的AtAAPs基因都定位在質(zhì)膜上，并且在轉(zhuǎn)運氨基酸的時候常常伴隨著氫離子的跨膜轉(zhuǎn)運[2]。AtAAPs在植物中參與到一系列的生理過程，例如參與根對土壤中氨基酸的吸收，氨基酸的遠距離轉(zhuǎn)運等[12，16，18， 44，47，62-63]。AtAAP1基因主要在葉和胚乳中表達，并且參與轉(zhuǎn)運氨基酸到根和胚中[27，44，63]。AtAAP5基因主要在根吸收土壤中的氨基酸的過程中起重要的作用，也可能參與轉(zhuǎn)運氨基酸到胚這一過程[18]。通過對AtAAP6基因突變體的研究發(fā)現(xiàn)AtAAP6基因在調(diào)控分子篩的組成方面起重要的作用[12]。AtAAP8基因可能在擬南芥種子早期發(fā)育的過程中參與轉(zhuǎn)運氨基酸到胚乳和種子這一過程[31]。LHTs基因家族中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白可以轉(zhuǎn)運酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸，并且發(fā)現(xiàn)它們參與氨基酸從細胞壁到細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程、有機氮運輸?shù)礁腿~肉細胞的過程，也有報道稱它們參與有機氮運輸?shù)交ǚ奂捌渌辰M織器官的過程[3，15，16]。除了在擬南芥中這些氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究比較深入外，而在別的植物中也有一些研究[37，45，62]，例如StAAP1、Vf AAP1、Vf AAP3、PvAAP1和Pt AAP11。

在水稻中，也有氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的功能研究。在水稻的突變體庫中找到13個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白突變基因，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變體并不影響分蘗數(shù)和千粒重等產(chǎn)量性狀，osaa49卻能夠降低37.7%的水稻產(chǎn)量[10]。有的突變體卻對水稻植株的生物量有重要的抑制作用（例如突變體osaa5和osaa7）或者促進作用（例如突變體osaa24），進一步研究發(fā)現(xiàn)這些突變體能夠改變水稻種子中碳和氮的比例及其相對含量[10]。在水稻中還鑒定到一個控制稻殼為黑色（在普通野生稻中）的基因（Bh4），發(fā)現(xiàn)它編碼一個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，該基因在栽培稻中位于第三外顯子中存在一個22-bp的缺失突變，這將導(dǎo)致其稻殼顏色變?yōu)闇\黃色，并且推測Bh4可能與馴化有關(guān)[7]。最近，我們在水稻自然群體中克隆到一個控制稻米儲藏蛋白含量的主效QTL基因OsAAP6，它屬于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族中的氨基酸透性酶基因亞家族中的一員[9]。OsAAP6基因是一個組成型表達的基因，它在水稻的微管組織中表達相對較高，OsAAP6通過調(diào)控水稻種子儲藏蛋白和淀粉的合成與積累來調(diào)控稻米的營養(yǎng)品質(zhì)并影響其食味品質(zhì)，但是OsAAP6是如何調(diào)控這一過程的還在進一步的研究當(dāng)中。

5 展望

在植物中有各種各樣的氨基酸，它們在植物的生長、發(fā)育和代謝的過程中起非常重要的作用，這是因為氨基酸是各種酶和蛋白質(zhì)合成的基本元件，并且氨基酸是一些對植物發(fā)育起重要作用物質(zhì)（如核酸、葉綠體、激素和次生代謝物質(zhì)等）的前體或者氮供體，然而氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在體內(nèi)或者細胞間氨基酸的轉(zhuǎn)運過程中扮演極其重要的角色。在雙子葉植物以擬南芥為例，大批氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因被成功分離、克隆，基因的功能得到深入細致的研究；在單子葉植物水稻中，全基因組內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族成員目前已經(jīng)確定，家族成員的表達模式和分子特征得到解析和驗證[8，10]，相關(guān)的水稻突變體也進行了大田試驗[10]。目前在重要的糧食作物水稻中有兩個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族成員被克隆，并初步揭示其基因的功能[7，9]。但是，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白向細胞內(nèi)或者向細胞外轉(zhuǎn)運氨基酸的分子機制還不是很清楚，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白是如何調(diào)控其功能的？以及在氨基酸信號通路當(dāng)中是如何發(fā)揮重要作用的？相信隨著生物技術(shù)和功能基因組的快速發(fā)展，越來越多的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因在模式植物中得到分離、克隆，它們的生物學(xué)功能將會逐漸得到解析，并應(yīng)用于主要糧食作物的遺傳改良。

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