木麻黃紅根病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定

陳禮浪　李增平

摘 要 對(duì)引起木麻黃紅根病的病原菌進(jìn)行鑒定，并測(cè)定該病原菌的生物學(xué)特性。結(jié)果表明：致病性測(cè)定接種后木麻黃罹病癥狀與田間癥狀相似，根據(jù)病原菌子實(shí)體形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和ITS序列分析，確定引起木麻黃紅根病病原菌為熱帶靈芝[Ganoderma tropicum（Jungh.）Bres.]。病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用；菌絲生長(zhǎng)的最適宜溫度為30 ℃，最適pH值為6.0；在以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，最適碳源為蔗糖。

關(guān)鍵詞 木麻黃；紅根?。粺釒ъ`芝；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S792.93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen causing Casuarina equisetifolia red root were reported in this study. A kind of fungus was isolated from the diseased trees which could cause similar symptoms as that in fields by inoculating trees. According to basidiocarp of the pathogen morphology， microstructure and the sequence of ITS， the pathogen was identified as Ganoderma tropicum（Jungh.）Bres. Biological characteristics tests showed that light treatments was not conducive to mycelia growth； The optimum temperature and pH for mycelia growth were 30 ℃ and 6.0； Soya Peptone was the best nitrogen source for mycelia growth. Sucrose was better than the other carbon sources.

Key words Casuarina equisetifolia；Red root；Ganoderma tropicum；Biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.023

海南島素有“臺(tái)風(fēng)走廊”之稱，臺(tái)風(fēng)是海南的主要自然災(zāi)害之一。木麻黃（Casuarina equisetifolia L.）是沿海地區(qū)海岸防護(hù)林的主要樹種之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[1-3]。近年來，筆者在?？?、陵水、昌江、儋州、臨高、萬寧、八所、樂東等市縣的木麻黃林地中調(diào)查發(fā)現(xiàn)一些長(zhǎng)勢(shì)衰弱的木麻黃，其活立木莖干基部和露出地表的樹根上長(zhǎng)有一種靈芝屬真菌的擔(dān)子果，鄰近的部分重病株整株枯死，在林間形成明顯的發(fā)病中心。將病株的根部挖出后，發(fā)現(xiàn)在病根表面粘了一層泥沙，用水沖洗后可見棗紅色和黑紅色革質(zhì)菌膜。發(fā)病后期的病根木質(zhì)部呈松軟的海綿狀，具有濃烈的蘑菇味，根據(jù)癥狀特征診斷為紅根病，目前在文獻(xiàn)中尚未見有關(guān)木麻黃紅根病的相關(guān)報(bào)道。本研究針對(duì)此病原靈芝菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，并對(duì)分離物進(jìn)行致病性測(cè)定、病原鑒定和生物學(xué)特性測(cè)定，以便為該病害的生產(chǎn)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 病原菌采自海南省?？?、陵水、昌江、儋州、臨高、萬寧、八所、樂東等市縣發(fā)病的木麻黃活立木莖基部和近地表的根部，將患病部位長(zhǎng)出的新鮮擔(dān)子果樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行組織分離培養(yǎng)。

1.1.2 病原菌分離和培養(yǎng) 按以下的操作步驟將采回的新鮮擔(dān)子果在超凈工作臺(tái)進(jìn)行分離純化：①用70%酒精棉球擦拭擔(dān)子果表面待分離部位2～3次。②使用在酒精燈火焰上灼燒滅菌并冷卻后的手術(shù)刀削去分離部位的表皮，切取擔(dān)子果內(nèi)層大小約5 mm×5 mm的菌組織塊放置到PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)。③待初次分離的組織塊邊緣長(zhǎng)出白色菌絲后，從菌落邊緣挑取約5 mm×5 mm的菌絲塊移接到新的PDA平板中純化，待菌落長(zhǎng)好后置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉13 g、水1 000 mL。Czapek培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉13 g、蒸餾水1 000 mL。木屑培養(yǎng)基：按木屑82%、麥麩15%、葡萄糖2%、石膏1%，加水潤(rùn)濕并混勻后分裝到底面直徑4 cm、高約7 cm的塑料袋中，封口，121 ℃濕熱滅菌2 h。

1.2 方法

1.2.1 致病性測(cè)定 參考高秀兵等[4]的接種方法制做接種體，并進(jìn)行致病性測(cè)定。 （1）從純化培養(yǎng)的待測(cè)菌菌落邊緣切取邊長(zhǎng)1 cm的正方形菌塊，接種到木屑培養(yǎng)基菌袋中培養(yǎng)制做接種體。以不接菌的木屑培養(yǎng)基制作菌棒作為對(duì)照。 （2）待菌袋的菌絲長(zhǎng)滿后，將待接的木麻黃苗木根基部土刨開，使主根暴露出來，用小刀在主根上削一個(gè)約3 cm長(zhǎng)的平面切口，然后在接種體菌棒上剪一個(gè)大小相近的缺口，將接種體緊貼在傷口上，兩端附上濕棉花，用保鮮袋裹住并用綁帶固定，埋土，澆少量水。每個(gè)接種物設(shè)5個(gè)重復(fù)，以未接菌的木屑培養(yǎng)基制作菌棒進(jìn)行同樣接種作為對(duì)照。 （3）接種后逐月觀察苗木長(zhǎng)勢(shì)，然后把基部的土刨開觀察根部受侵染情況，并作記錄。

1.2.2 病原菌鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定： 根據(jù)《中國(guó)真菌志》第十八卷靈芝科和《中國(guó)靈芝圖鑒》等參考資料對(duì)病原菌的擔(dān)子果的宏觀特征和顯微形態(tài)描述進(jìn)行鑒定[5-6]。

（2）rDNA-ITS序列：刮取PDA平板培養(yǎng)的病原菌菌絲，經(jīng)液氮充分研磨后，用DNA提取試劑盒提取DNA，以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGA

ACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA

TGC-3′）對(duì)rDNA-ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用TaKaRa pMD18-T Vector試劑盒進(jìn)行ITS片段連接，連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化E. Coli Trans5α構(gòu)建重組載體，LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后挑取陽性克隆菌，置于LB培養(yǎng)液培養(yǎng)后送測(cè)序公司（華大基因）測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站用Blastn進(jìn)行比對(duì)，分析其相似性。

1.2.3 生物學(xué)特性測(cè)定 選菌齡一致的供試菌落，用打孔器在邊緣打直徑5 mm的圓形菌餅備用，除溫度外其余試驗(yàn)條件均在28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。設(shè)置以下試驗(yàn)條件（溫度：在黑暗的條件下分別置于20、25、28、30、32、34、37、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。（光照： 照明燈為15 W，設(shè)置24 h光照、24 h黑暗、12 h光照和12 h黑暗3種光照條件PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。（pH值：將滅菌后的PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)至 2、3、4、5、6、7、8、9共8個(gè)梯度。 （碳、氮源：稱取等碳量的葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、肌醇、甘露醇和等氮量的硝酸鈉、硝酸鉀、大豆蛋白胨、L-天門冬酰胺、硫酸銨、氯化銨分別作為Czapek培養(yǎng)基中的碳源和氮源，并設(shè)置不加碳、氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。所有試驗(yàn)條件均釆用平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，將菌餅接至平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察其菌落生長(zhǎng)情況，5 d后測(cè)量菌落直徑，用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并生成圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 癥狀記述 受紅根病危害的木麻黃病株樹冠稀疏，枯枝多，3～5 a后整株枯死，9～12月間在病樹的莖干、近地面的莖基部和暴露的樹根上長(zhǎng)出鮮艷的擔(dān)子果，病株易被強(qiáng)風(fēng)連根吹倒。病樹根表面平粘一層泥沙，濕度大時(shí)病根表面長(zhǎng)有灰白色菌絲體，用水沖洗后可見棗紅色和黑紅色革質(zhì)菌膜。后期病根的木質(zhì)部松軟呈海綿狀，并散發(fā)出濃烈的蘑菇味（圖1）。

2.1.2 致病性測(cè)定 2個(gè)月后檢查接種了分離菌的木麻黃苗木根部受侵染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有白色菌絲向接種體兩端沿根蔓延擴(kuò)展，病株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，枝葉稀疏，約8個(gè)月后整株枯死。對(duì)枯死的木麻黃苗木根部檢查后發(fā)現(xiàn)其根表粘一層泥沙，并有棗紅色革質(zhì)菌膜，菌膜邊緣呈白色，老熟菌絲組織變紅黑色。癥狀與田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)的紅根病癥狀相符，對(duì)照則無發(fā)病表現(xiàn)，表明該分離菌為木麻黃紅根病病原菌（圖2）。

2.1.3 病原菌形態(tài) ①菌落生長(zhǎng)特性：在PDA培養(yǎng)基中病菌菌落呈白色，濃密，邊緣整齊，平伏生長(zhǎng)，無特殊氣味。菌絲生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)到6 d時(shí)直徑可達(dá)8.5 cm。

②子實(shí)體形態(tài)：擔(dān)子果通常單生、無柄或有短柄；菌蓋半圓形、近圓形、近腎形或近漏斗形，干燥后質(zhì)量變輕，大小為5～25 cm×4.5～16 cm，厚1.5～2.3 cm；新鮮擔(dān)子果菌蓋表面紅褐色、紫紅色或紫褐色，有較強(qiáng)或弱的似漆樣光澤，邊緣厚實(shí)，向邊緣顏色常由深至淺漸變，變淺至淡黃褐色、黃白色和白色；菌肉褐色，幼小子實(shí)體顏色常不均勻，呈淡褐色和咖啡色，厚約1.5 cm，無黑色殼質(zhì)層；菌管長(zhǎng)0.1～0.2 cm，褐色?？酌嫖郯咨恋稚?；管口近圓形，每毫米3～4個(gè)；菌柄側(cè)生、粗短、圓柱形，與菌蓋同色或較菌蓋色深，紫紅色或紫黑色，長(zhǎng)可達(dá)5.6 cm，直徑可達(dá)2.5 cm（圖3）。

③顯微結(jié)構(gòu)：皮殼構(gòu)造擬子實(shí)層型，黃褐色。菌絲系統(tǒng)三體型，生殖菌絲透明、薄壁，直徑1.5～2.5 μm；骨架菌絲黃褐色，厚壁至實(shí)心，干直徑為2～4 μm，樹狀分支。纏繞菌絲無色，厚壁至實(shí)心，直徑1～2.0 μm。擔(dān)孢子卵圓形至寬橢圓形，頂端稍平截，黃褐色，雙層壁，內(nèi)壁有顯著小刺，大小為8.8～11.1（9.95）μm×6.6～7.4（6.97）μm，長(zhǎng)寬比Q=1.42（圖4）。

④ITS序列比對(duì)：將測(cè)序所得序列在NCBI比對(duì)，結(jié)果表明與其相似度最高的序列為已登錄的熱帶靈芝序列，相似度達(dá)99%。

病原菌形態(tài)特征與《中國(guó)靈芝圖鑒》和《中國(guó)真菌志》第十八卷靈芝科中熱帶靈芝的描述相符，綜合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征及ITS序列分析結(jié)果，鑒定該病原菌為熱帶靈芝Ganoderma tropicum（Jungh.）Bres.。

2.2 生物學(xué)特性

2.2.1 溫度 菌絲在20～37 ℃均能生長(zhǎng)，隨著溫度升高，在20～30 ℃時(shí)菌落直徑也增加，而后逐漸減少，到40 ℃時(shí)生長(zhǎng)完全停止，但是并未死亡，在溫度適宜時(shí)仍可再次生長(zhǎng)，這一特點(diǎn)和鄧軍等[7]報(bào)道的結(jié)果一致。菌落直徑在30 ℃時(shí)達(dá)到高峰，可見高溫有利于菌絲生長(zhǎng)（圖5）。

2.2.2 光照 比較3種光照條件下菌絲的生長(zhǎng)情況，完全黑暗條件下長(zhǎng)勢(shì)最好，與全光照和光暗交替條件下培養(yǎng)的菌落直徑差距明顯（圖6），可見黑暗有利于菌絲生長(zhǎng)，光照則會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)。光暗交替條件下培養(yǎng)的菌落生長(zhǎng)受到明顯的抑制，說明只需要一定時(shí)間的光照后菌絲生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。光暗交替及全光照條件下培養(yǎng)的菌落背面發(fā)黃，可能光照過強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致菌落發(fā)黃老化。

2.2.3 pH值 在pH值3.0～8.0時(shí)菌絲均能生長(zhǎng)，最適宜菌絲生長(zhǎng)的pH值為6.0（圖7），說明偏酸的環(huán)境有利于菌絲生長(zhǎng)，酸性或堿性過強(qiáng)則會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

2.2.4 碳、氮源 在測(cè)試的碳源中，以蔗糖為碳源的菌落長(zhǎng)勢(shì)最佳。糖類為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落白色，??；而肌醇、甘露醇和未加碳源的對(duì)照菌落長(zhǎng)勢(shì)差，幾乎成透明狀。表明熱帶靈芝對(duì)糖類碳源利用率優(yōu)于醇類。在不同的糖類作為碳源的菌落中，菌落直徑也有一定的差異，并且其中乳糖作碳源的菌落直徑及菌絲厚度都較差，表明熱帶靈芝能利用單糖、雙糖、多糖作為碳源，但是不同的碳源或同類型碳源的不同種類之間利用能力存在一定差異（表1）。

測(cè)試的氮源中，在以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最好，其次是天門冬酰胺、氯化銨和硫酸銨，而硝酸鈉和硝酸鉀與未加氮源的對(duì)照菌落相似，近乎透明，長(zhǎng)勢(shì)很差，表明硝酸鹽不容易被熱帶靈芝利用。氮源的利用能力從強(qiáng)到弱依次為：有機(jī)氮>銨態(tài)氮>硝態(tài)氮（表2）。

3 討論與結(jié)論

靈芝屬真菌是引起植物根部病害的主要病原菌之一。此前國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道了由 Ganoderma philippii（Bres.et. Henn）Bres.和Ganoderma pseudoferreum（Wakef）Over.et Steinm引起的橡膠樹紅根病、 G. lucidum（Leyss.ex Fr）Larst引起的檳榔紅根病、G. boninense 引起的油棕莖基腐病和G. theaecolum J.D.Zhao引起的茶樹紅根病[5，8-11]。而木麻黃紅根病的病原菌為熱帶靈芝[Ganoderma tropicum（Jungh.）Bres.]，表明多種靈芝都可侵染植物根部，引致類似的紅根病癥狀。與目前已報(bào)道的紅根病的病原靈芝菌進(jìn)行比較，引起橡膠樹紅根病的Ganoderma philippii 和Ganoderma pseudoferreum屬于樹舌亞屬，表面無漆樣光澤，具有類交織型的皮殼結(jié)構(gòu)且孢子無小刺；G. lucidum和G. theaecolum 菌肉分層，而Ganoderma tropicum菌肉呈均勻褐色，并且G. lucidum具有灰球菌型纏繞菌絲；G. Boninense孢子狹長(zhǎng)且無小刺或具微刺，表面常呈紫黑色，并有細(xì)密的輪溝；而Ganoderma tropicum表面環(huán)紋不明顯或無，孢子具有小刺，卵圓形，并且常常呈紅色，有時(shí)近邊緣顏色漸淺。Ganoderma tropicum與目前已報(bào)道的其他紅根病病原靈芝較容易區(qū)別。2004年戴玉成等[12]報(bào)道了熱帶靈芝引起的臺(tái)灣相思樹的干基腐朽病，這是國(guó)內(nèi)把熱帶靈芝作為林木病原菌的首次報(bào)道。秦凡文等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)該菌還可侵染桉樹活立木和生長(zhǎng)于橡膠樹枯死木上。熱帶靈芝對(duì)不同植物的致病性不盡相同，可侵染木麻黃、臺(tái)灣相思、馬占相思、桉樹等引起根腐病，但對(duì)橡膠樹則無致病性，只是腐生在其死樹頭上，是否其本身存在不同的小種還是存在寄主選擇性，還有待進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果表明光照會(huì)抑制該病原菌菌絲的生長(zhǎng)；在pH值為6.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最好，菌絲的生長(zhǎng)喜偏酸環(huán)境；菌絲生長(zhǎng)較適宜的溫度范圍較廣，為28～37 ℃，在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)達(dá)到高峰。作為培養(yǎng)基的最適碳源為糖類，其中蔗糖利用率最佳；最適氮源為有機(jī)氮源大豆蛋白胨，幾乎不能利用硝酸鹽類碳源。1992年鄧軍等[7]通過測(cè)量不同溫度下熱帶靈芝在木屑培養(yǎng)基中菌絲柱長(zhǎng)度，通過回歸方程計(jì)算最佳生長(zhǎng)溫度為28.8 ℃，與本研究在平板中培養(yǎng)測(cè)定的菌絲生長(zhǎng)結(jié)果有差異；菌絲生長(zhǎng)的最佳pH值為5.9，與本研究結(jié)果相符，但其未測(cè)試碳氮源的利用效率。

熱帶靈芝除能引起植物根腐病外，本身還具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。在中國(guó)已知的104種靈芝中，已有14種被利用。除熱帶靈芝外，還有些種類如橡膠樹靈芝、樹舌等也是林木的病原菌，會(huì)給農(nóng)業(yè)和林業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，但他們同時(shí)也是具有潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用真菌。因此對(duì)病原靈芝所致林木病害的深入研究的同時(shí)，也應(yīng)對(duì)該類真菌的藥用價(jià)值進(jìn)行深入研究，使其變害為寶。

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