利用冰凍切片法觀察艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)

陳曉鷺　劉立偉　楊全　龐玉新

摘 要 應用冰凍切片法觀察艾納香成熟葉的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，優(yōu)化的冰凍切片方法為：取新鮮葉片，不經(jīng)預處理，直接切取4 mm×4 mm小塊，用冷凝膠包埋，冷凝箱溫度和樣品夾溫度-18 °C，冷凝時間10 min，修片后取出并置于室溫20 ℃條件下回溫30 s，移回樣品夾后30 s內(nèi)切片，切片厚度20 μm，用潔凈載玻片吸片，于光鏡下觀察。成熟艾納香葉為異面葉，厚度約110 μm；柵欄組織和海綿組織分化明顯，柵欄組織由1層排列緊密的柱狀細胞組成，海綿組織有發(fā)達的細胞間隙，兩者之比為0.82～1.22；葉中脈發(fā)達，主脈散生，外韌維管束6～10個，由厚壁細胞組成維管束鞘，導管為螺紋；葉上、下表皮均有大量非腺毛和腺毛分布，葉表皮的腺毛為雙列多細胞組成的頭狀腺毛。本研究結(jié)果確定了利用冰凍切片研究艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)簡便可行，為艾納香屬植物分類鑒定、品種整理等提供參考，并為進一步研究艾納香的結(jié)構(gòu)和發(fā)育積累經(jīng)驗。

關鍵詞 艾納香；娜龍；葉；腺毛；顯微結(jié)構(gòu)；冰凍切片

中圖分類號 Q944.5 文獻標識碼 A

Abstract This paper studies the microstructure of sambongs leaf by freeze-sectioning. The optimized method is to collect a fresh and healthy adult leaf and cut a piece from it with an area of 4 mm×4 mm without pretreatment. Then the piece is embedded with Jung tissue freezing medium under -18 ℃ for 10 min， and then placed under room temperature at 20 ℃ for 30 seconds and cut under -18℃ within 30 s. The section thickness is 20 μm. A glass slide is used to stick the section. The section is observed with a optical microscope. The results showed that the ainaxiang leaf is typically bifacial and is with a thickness of about 110 μm. Palisade tissue and spongy tissue in leaves are differentiated. Palisade tissue is composes of columnar cells closely arranged one layer. Intercellular space of spongy tissue is developed. The ratio of palisade tissue thickness to spongy tissue thickness ranges from 0.82 ∶ 1 to 1.22 ∶ 1. Midrib is developed. Six to eight collateral vascular bundles are loosely arranged in midrib. Vascular bundle is consists of spiral vessels inside and sclerenchyma cells around as vascular bundle sheath. Both non-glandular hairs and glandular hairs are occurred frequently in both sides of adult leaves. The glandular hairs are capitate trichomes consists of several cells arrange in two lines. Above results confirm that the feasibility and convenience of studying ainaxiang leaf microstructure with freezing sections. This finding may help better taxonomical study of Blumea plants， and add some information for further study on microstructure and development of this plant.

Key words Blumea balsamifera；sambong；Leaf；Glandular hair；Microstructure；Freezing section

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.006

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]又名冰片艾、大風艾，為多年生菊科（Asteraceae）艾納香屬木質(zhì)草本藥用植物，主要分布在中國的貴州、海南、廣東、臺灣等地以及菲律賓、越南、馬來西亞等國[1-2]，在中國少數(shù)民族地區(qū)又稱之為“娜龍”、“檔窩凱”等。艾納香具有開竅醒神、清熱止痛等功效，已有數(shù)百年的藥用歷史，最主要藥用部位為葉，是提取中藥艾片（左旋龍腦）的唯一資源植物[3]，也是熱區(qū)新興的藥用經(jīng)濟作物[1]，目前艾納香植株及其提取物（如艾片、艾粉和艾納香油等）已被廣泛應用于中成藥、化妝品、食品等領域。在長期的民間使用過程中，由于艾納香植株外觀特性并不突出，缺乏獨特易辨的葉型、葉色、花型或花色等，導致把艾納香與同屬其他種的植物混淆使用的情況時有發(fā)生，如六耳鈴、柔毛艾納香等。由于誤用或種植了其他植物而影響治療效果或提取效率的情況時有發(fā)生。研究艾納香的顯微結(jié)構(gòu)將有助于理清艾納香屬植物的分類，為其植物學鑒定和分類補充資料，同時為了解和評價艾納香藥材質(zhì)量積累經(jīng)驗，進而為艾納香良種選育提供參考。

近年來，圍繞艾納香已經(jīng)展開多方面研究，包括植物資源[4-5]、化學成分分析[6-12]、提取工藝優(yōu)化[13-16]、藥理功效評價[17-20]、安全性評價[21-22]、功效基因克隆[23]和、田間栽培[24]和組培快繁[25]等，或是探討其不同生長期的外觀形態(tài)變化[26]。

隨著艾納香的社會、經(jīng)濟效益逐漸顯現(xiàn)，關于艾納香顯微結(jié)構(gòu)觀察、鑒定的研究也不斷增加。根據(jù)艾納香屬的經(jīng)典分類，艾納香的總苞片表皮毛全部為非腺毛，即沒有腺毛，這是區(qū)分艾納香與同屬其他種的重要形態(tài)學特征[5，27]，但是，以總苞片表皮毛作為鑒定特征，只能在植物進入花期時進行，使鑒定工作受限于植物生長發(fā)育狀態(tài)，對于幼苗及其他非花期植株，則難以鑒定。林志云[28]利用中藥顯微鑒定技術研究后認為，艾納香的表皮上存在腺毛和非腺毛；安軍等[29]通過石蠟切片研究認為，艾納香表皮毛中絕大部分為非腺毛，僅偶見腺毛；池馨等[30]通過石蠟切片研究認為，艾納香葉含有分泌細胞，但是，未闡明分泌細胞的類型和形態(tài)，也未指出其是否具有腺毛。前人通過直接觀察、石蠟切片和粉末觀察等方法為研究艾納香的顯微結(jié)構(gòu)積累了經(jīng)驗，但關于其表皮毛的描述尚未達成一致。

冰凍切片技術操作便捷、耗時短，切片厚度可調(diào)范圍大，易于保留葉片表皮的毛狀結(jié)構(gòu)[31]。為進一步了解艾納香的形態(tài)學特征，為其補充植物分類和鑒定資料，完善基于顯微觀察的艾納香評價手段，有必要利用冰凍切片技術對艾納香葉的結(jié)構(gòu)進行進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的植物材料引種自海南省儋州市郊，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥研究室龐玉新研究員鑒定，為艾納香屬植物艾納香。經(jīng)引種，保存在位于海南省儋州市的農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃中，露天栽培，常規(guī)水肥管理。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片方法的優(yōu)選 （1）不同冷凝溫度對艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用冰凍切片機專用的萊卡 （Leica）Jung組織冷凍劑（批號：03663438 2013 06）在載物臺上直接包埋，分別在-10、-18、-28 ℃環(huán)境下冷凝10 min，修片后切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

（2）不同冷凝時間對艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用Jung組織冷凍劑在載物臺上直接包埋，分別于-18 ℃下冷凝5、10、30 min，修片后切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

（3）不同回溫操作時間對艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用Jung組織冷凍劑在載物臺上直接包埋，于-18 ℃下冷凝10 min后修片，分別回溫[32][將載物臺連同包埋塊拿到切片機冷凍箱外，在室溫（20 ℃）環(huán)境下放置一段時間，使包埋塊溫度回升]0、10、30、90 s后將其重新固定在樣品夾上，30 s內(nèi)切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

1.2.2 艾納香葉片冰凍切片與觀察 試驗采用優(yōu)化后的冰凍切片法對艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)進行切片，具體步驟：取潔凈健康無病蟲害的新鮮成熟葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片及葉片中部的主脈各一方塊（4 mm×4 mm），使用Jung組織冷凍劑固定，在載物臺上直接進行包埋，分別在-18 ℃環(huán)境下冷凝10 min，待材料迅速冷卻并固定在載物臺上后進行修片，回溫[32]30 s后重新將其固定在樣品夾上，在30 s內(nèi)進行切片，切片厚度為20～30 μm，用潔凈載玻片吸貼[33]，在德國萊卡（Leica）DMI4000B數(shù)碼光學顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 包埋塊穩(wěn)定度按以下公式計算：包埋塊穩(wěn)定度/%=（1-修塊或切片過程中脫落的包埋塊個數(shù)/包埋塊總數(shù)）×100；照片經(jīng)Adobe Photoshop CC圖像處理系統(tǒng)處理制版；數(shù)據(jù)分析采用IBM公司的 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）19.0軟件進行，數(shù)據(jù)記錄格式為平均值±標準誤差（SD）。2組數(shù)據(jù)的差異顯著性分析使用獨立樣本t檢驗；3組或以上數(shù)據(jù)的差異顯著性分析使用鄧肯氏多重范圍比較（Duncans New Multiple Range Test），差異顯著性水平定為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰凍切片方法的優(yōu)選

2.1.1 不同冷凝溫度對艾納香葉冰凍切片的效果比較 分別比較了冷凝溫度為-10、-18、-28 ℃（冷凝10 min時）的切片效果，結(jié)果見表1和圖1，包埋穩(wěn)定度隨冷凝溫度的下降而上升，冷凍箱和樣品夾的冷凝溫度均設定為-18 ℃時效果較好（圖1-A）。當溫度為-10 ℃時，葉片橫切面結(jié)構(gòu)被擠壓變形，且修塊和切片過程中包埋塊容易脫落；當溫度為-28 ℃時，葉片組織容易碎裂，造成切片不完整（圖1-B）。

2.1.2 不同冷凝時間對艾納香葉冰凍切片的效果比較 從表2可知，包埋穩(wěn)定度隨冷凝時間的延長而上升。在-18 ℃冷凝10 min最適合，此時切片較完整（圖2-A）。冷凝時間為5 min時，冷凝膠未能完全凝固，且貼緊載物臺，在修片和切片的過程中，容易導致包埋塊滑落；冷凝時間為30 min時，樣品組織發(fā)生碎裂，難以觀察完整的組織形態(tài)（圖2-B）。

2.1.3 不同回溫操作時間對艾納香葉冰凍切片的效果比較 從表3可知，包埋穩(wěn)定度隨回溫時間的延長而有所下降，但在90 s內(nèi)下降不顯著。在對艾納香葉進行冰凍切片時，適當進行回溫操作有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的切片。在冷凝溫度為-18 ℃、冷凝時間為10 min、室溫為20 ℃的條件下，回溫時間為30 s效果最佳（圖3-A）?；販貢r間為10 s時，切片結(jié)果與不進行回溫操作的結(jié)果相似，均容易使組織破碎；回溫時間為90 s時，容易導致切片實際厚度大于設定的厚度，且艾納香的葉肉結(jié)構(gòu)變形（圖3-B）。

2.2 艾納香葉片冰凍切片與觀察

艾納香葉為羽狀網(wǎng)脈，成熟中脈和側(cè)脈在上面可辨，下面明顯凸起（圖4-A）。橫切面上，中脈最粗。葉中脈處，上表皮細胞與維管束之間靠近表皮處有6～9層細胞壁加厚的厚角組織，與兩邊的柵欄組織相連，厚角組織以內(nèi)有3～8層薄壁細胞。下表皮細胞外角質(zhì)層有明顯加厚，下表皮內(nèi)2～6層為厚角組織，其內(nèi)為6～7層較疏松的薄壁細胞，薄壁細胞較大，兩側(cè)與兩邊的海綿組織相連。上、下表皮均有大量表皮毛分布，有非腺毛和腺毛。葉中脈橫切面上，維管束呈扇形排列，為外韌維管束，約4～11個，維管束的韌皮部外有厚角組織構(gòu)成的維管柱鞘。木質(zhì)部導管為螺紋導管。

成熟葉片厚度為（110.19±1.01）μm，葉肉組織發(fā)達，柵欄組織和海綿組織的分化明顯。柵欄組織由1層排列較緊密的柱狀細胞構(gòu)成，厚度為（36.10±0.44）μm，含有豐富的葉綠體；海綿組織細胞排列較疏松，細胞間隙發(fā)達（圖4-B），厚度為（44.26±0.92）μm，柵海比為0.82～1.22。

葉片橫切面上、下表皮細胞大小相近，多為不規(guī)則形或近方形，葉脈下表皮處表皮細胞為規(guī)則的圓形或近方形（圖4-B）。上表皮厚度為（17.45± 0.42）μm，下表皮厚度為（7.87±0.22）μm，獨立樣本t檢驗結(jié)果顯示，上表皮厚度顯著大于下表皮厚度。上、下表皮均可見非腺毛和腺毛分布，大部分腺毛長度約為48 μm。腺毛的形態(tài)為頭狀腺毛，由基細胞、柄細胞和分泌細胞組成，其中，基細胞1個或2個并排，柄細胞1～2對并排形成，分泌細胞1～6對，頂部的分泌細胞由1對半球形細胞并排形成，在分泌細胞外可見由分泌物構(gòu)成的一層半透明囊泡包裹（圖4-C）。

3 討論與結(jié)論

前人對艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)的研究主要是通過石蠟切片技術或中藥顯微鑒定的手段對包含葉在內(nèi)的全草粉末進行顯微觀察[28-30]。相對于石蠟切片，本研究通過使用冰凍切片進行操作，觀察和統(tǒng)計結(jié)果與前人利用石蠟切片所觀察到的葉肉部分的顯微結(jié)構(gòu)特征[30]一致，確定利用冰凍切片技術對艾納香葉的顯微結(jié)構(gòu)進行觀察的方法可行。此外，利用冰凍切片操作具有操作簡便、節(jié)省時間等優(yōu)點[31-32]，便于大量操作，在研究艾納香葉的數(shù)量性狀方面更具有較大的優(yōu)勢，如用于評估其顯微結(jié)構(gòu)差異與有效成分積累差異之間的關系等。

優(yōu)化后的艾納香葉冰凍切片方法為：取新鮮葉片，不經(jīng)預處理，直接切取4 mm×4 mm的小塊，用冷凝膠包埋，冷凝箱溫度和樣品夾溫度均為-18 ℃，冷凝時間為10 min，修片后取出并將其置于室溫（20 ℃）條件下回溫30 s，移回樣品夾后30 s內(nèi)切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸片，于光學顯微鏡明場下觀察并拍照記錄。

精油是艾納香葉中具有重要生物活性的內(nèi)含物[2，20-21]，而關于艾納香的精油分泌結(jié)構(gòu)的類型與特征尚未有定論。艾納香葉上、下表面均附有長而濃密的非腺毛，不易移除，阻擋視線，增加了對葉表皮其他結(jié)構(gòu)直接觀察的難度。至今，關于艾納香表皮毛中是否存在腺毛及腺毛的多寡尚存在一些爭議[27-30]。本研究通過進行冰凍切片，確定了腺毛大量存在于艾納香葉表面，獲得了完整、清晰的艾納香葉表皮腺毛的照片，可清晰地觀察到由雙列多細胞排列而成的頭狀腺毛。這些結(jié)果支持了部分學者認為艾納香存在腺毛的觀點[29]，池馨等[30]雖未明確闡述艾納香表皮腺毛存在與否，但從其石蠟切片照片中可辨認出部分結(jié)構(gòu)與本研究所觀察到的腺毛結(jié)構(gòu)一致。不過，在本研究的艾納香葉表皮中僅觀察到一種腺毛，即雙列多細胞排列的頭狀腺毛，未觀察到林志云[28]報道的單列細胞排列的頭狀腺毛，可能是因為本研究觀察對象為成熟葉片，而前人觀察的是全草粉末，即由于觀察的植物部位范圍不同或觀察的材料狀態(tài)不同所致。本研究結(jié)果確定利用冰凍切片技術觀察艾納香表皮毛的方法可行，且相對于石蠟切片而言，不需要有機溶劑固定，更快捷便利；相對于粉末顯微觀察而言，不需要進行干燥、打粉等處理，對艾納香及更多植物的分類、鑒定、觀察具有參考價值；此外，通過本研究可知，艾納香表皮在非腺毛覆蓋之下具有大量腺毛，這也為從顯微結(jié)構(gòu)角度研究和評價艾納香精油的積累模式提供參考。

參考文獻

[1]官玲亮， 龐玉新， 王 丹， 等. 中國民族特色藥材艾納香研究進展[J]. 植物遺傳資源學報， 2012， 13（4）： 695-698.

[2] Pang Y X， Wang D， Fan Z W， et al. Blumea balsamifera-A phytochemical and pharmacological review[J]. Molecules， 2014， 19（7）： 9 453-9 477.

[3] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

[4]江維克， 周 濤， 何 平， 等. 貴州紅水河地區(qū)艾納香植物資源調(diào)查及其保護策略[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2010， 38（8）：1-4.

[5]袁 媛， 龐玉新， 王文全， 等. 中國艾納香屬植物資源與民族藥學研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2011， 31（4）： 22-27.

[6] 夏稷子， 陳 貴， 安 軍， 等. 艾納香揮發(fā)油和左旋龍腦在不同葉型及不同部位的分布[J]. 中成藥， 2014， 36（8）： 1 719-1 721.

[7]劉進濤， 靳鳳云， 章 譽， 等. 貴州羅甸艾納香中左旋龍腦的含量測定[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報， 2013， 35（01）： 16-18.

[8] Tan D， Yan Q， Kang H. Chemical constituents from Blumea balsamifera[J]. Chemistry of Natural Compounds， 2013， 48（6）：1 072-1 073.

[9] Xu J， Jin D， Liu C， et al. Isolation， Characterization， and NO Inhibitory activities of sesquiterpenes from Blumea balsamifera[J]. Journal of agricultural and food chemistry， 2012， 60（32）： 8 051-8 058.

[10] Chu S S， Du S S， Liu Z L. Fumigant compounds from the essential Oil of Chinese Blumea balsamifera leaves against the maize weevil（Sitophilus zeamais）[J]. Journal of Chemistry， 2013： 1-7.

[11] Bhuiyan M N I， Chowdhury J U， Begum J. Chemical components in volatile oil from Blumea balsamifera （L.） DC. [J]. Bangladesh Journal of Botany， 2009， 38（1）： 107-109.

[12]龐玉新， 黃 梅， 于福來， 等. 黔瓊產(chǎn)艾納香中主要化學成分含量差異分析[J]. 廣東藥學院學報， 2014， 30（4）： 448-452.

[13]王 丹， 龐玉新， 張影波， 等. 一種艾納香油的提取方法： 中國， CN102851120A[P]. 2012.

[14]龐玉新， 靳德軍， 袁 媛， 等. 艾粉提取裝置： 中國， CN201334471[P]. 2009.

[15]龐玉新， 靳德軍， 袁 媛， 等. 一種艾納香加工提取設備： 中國， CN201485438U[P]. 2009.

[16] Wang Y， Tian H， Wang A， et al. A green and solvent-Free process for preparation of High-purity （-） -borneol from leaves of Blumea balsamifera （L） DC[J]. Tropical Journal of Pharmaceutical Research， 2014， 13（1）： 41-46.

[17]龐玉新， 袁 蕾， 王中洋， 等. 艾納香不同部位提取物的抗氧化活性及其對酪氨酸酶的抑制作用[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2014（18）： 4-8.

[18] Sakee U， Maneerat S， Cushnie T T， et al. Antimicrobial activity of Blumea balsamifera（Lin.）DC. extracts and essential oil[J]. Natural Product Research， 2011， 25（19）： 1 849-1 856.

[19] Saewan N， Koysomboon S， Chantrapromma K. Anti-tyrosinase and anti-cancer activities of flavonoids from Blumea balsamifera DC[J]. Journal of Medicinal Plants Research， 2011， 5（6）： 1 018-1 025.

[20] Pang Y X， Wang D， Hu X， et al. Effect of volatile oil from Blumea balsamifera （L.） DC. leaves on wound healing in mice[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine， 2014， 6（34）： 716-724.

[21] Pang Y X， Fan Z W， Wang D， et al. External application of the volatile Oil from Blumea balsamifera may be safe for liver-A study on its chemical composition and hepatotoxicity[J]. Molecules， 2014， 19（11）： 18 479-18 492.

[22]王 丹， 付萬進， 龐玉新， 等. 艾納香油過敏性和急性毒性實驗研究[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（12）： 2 499-2 502.

[23] Pang Y X， Guan L L， Wu L F， et al. Cloning and sequence analysis of the Blumea balsamifera DC farnesyl diphosphate synthase gene[J]. Genetics and Molecular Research， 2014， 13（4）： 9 874-9 882.

[24] 江興龍， 潘俊鋒， 司 健. 艾納香人工栽培技術[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2005， 19（2）： 68-70.

[25] 嚴 敏， 劉 艷， 湯洪敏. 艾納香的組織培養(yǎng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2014， 42（2）： 33-35.

[26]何元農(nóng)， 丁 映， 冼福榮， 等. 艾納香生長發(fā)育特性的初步觀測[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2005， 33（2）： 19-23.

[27] Chen Y S.， Anderberg A A. Flora of China（《中國植物志》英文修訂版）[EB/OL]. Beijing： China and St. Louis； USA： Science Press and & Missouri Botanical Garden Press， 2013. http：//foc.eflora.cn/content.aspx？TaxonId=200023545.

[28] 林志云. 艾納香及其混淆品大葉紫珠的鑒別[J]. 中藥材， 2005， 28（3）： 179-181.

[29] 安 軍， 夏稷子. 艾納香的顯微鑒別研究[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報， 2011， 33（6）： 7-8.

[30]池 馨， 劉濟明， 歐國騰， 等. 艾納香葉片顯微結(jié)構(gòu)及其親緣關系分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2014， 42（9）： 86-89.

[31]李建霞， 張出蘭， 夏曉飛， 等. 植物冰凍切片條件的優(yōu)化及其與石蠟切片在組織化學應用中的比較[J]. 植物學報， 2013， 48（6）： 643-650.

[32]寧代鋒， 尹增芳， 張 菁， 等. 一種簡單快速植物組織冰凍切片方法[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2008， 16（4）： 386-389.

[33] 張建國. 一種新冰凍切片制片方法[J]. 臨床與實驗病理學雜志， 1994（2）：185-186.