巴西橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞HblMYC3互作蛋白篩選與功能分析

王靖　鄧小敏　田維敏

摘 要 MYC是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的亞家族成員，在植物茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。HblMYC3是從巴西橡膠樹(shù)的乳管細(xì)胞中分離鑒定到的MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達(dá)受割膠和茉莉酸上調(diào)。采用酵母雙雜交方法初步篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在進(jìn)一步了解HblMYC3的功能。結(jié)果表明：HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧還蛋白2、含A20和 AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的脅迫相關(guān)蛋白5、28 ku熱和酸穩(wěn)定的磷蛋白以及25 ku泛素連接酶E2等7種蛋白不同程度地與HblMYC3蛋白互作?；谶@些互作蛋白的功能，推測(cè)HblMYC1或HblMYC2通過(guò)與HblMYC3形成二聚體對(duì)小橡膠粒子膜蛋白基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其他蛋白參與脅迫條件下維持二聚體的穩(wěn)定性和脅迫反應(yīng)后降解該二聚體。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù)；HblMYC3基因；酵母雙雜交；蛋白相互作用

中圖分類(lèi)號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)示碼 A

Abstract MYC transcription factors are the members of bHLH-type transcription factor superfamily and play an important role in jasmonate signaling transduction. Available data show that HblMYC3 gene is a typical MYC transcriptional factor gene and its transcripts are both enriched in laticifer cells and induced by tapping and exogenous JA. For further revealing its biological functions in laticifer cells， the yeast two-hybridization method was applied to screen candidate interacting partners of the HblMYC3. The results showed that HblMYC1， HblMYC2， DNAJ， glutaredoxin2， zinc finger A20 and AN1 domain-containing stress-associated protein 5， 28 ku heat- and acid-stable phosphoprotein and a 25 ku ubiquitin-conjugating enzyme E2 were detected to interact with HblMYC3 to varying degrees. Based on the reported functions of these candidate parterners， HblMYC1 or HblMYC2 may participate in the regulation of HblMYC3 on the SRPP gene expression in a dimer form， while the others contribute to the stability of the dimer during functioning and thereafter the digestion of the dimer through ubiquitin-mediated proteolysis.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.；HblMYC3 gene；Yeast two-hybridization；Protein interaction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.012

植物bHLH類(lèi)（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)和次生代謝調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程[1]。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、煙草（Nicotiana tabacum L.）和水稻（Oryza sativa L.）中已分離鑒定出各種類(lèi)型的bHLH類(lèi)亞家族成員[2]。其中MYC亞家族成員，其N(xiāo)端含有典型的MYC結(jié)構(gòu)域，能夠和CACGTG或CATGTG 特征的 E-box（CANNTG）又稱(chēng)為（MYC consensus motif）結(jié)合，在植物茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝中發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用[3]。

已有研究結(jié)果表明，MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵組分之一[4-5]。擬南芥中AtMYC2/3/4類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控?cái)M南芥表皮毛的發(fā)育、傷害反應(yīng)和對(duì)蟲(chóng)害的防御及次生代謝物質(zhì)合成[6]，表明MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是重要的逆境響應(yīng)調(diào)節(jié)因子，同時(shí)具有調(diào)控次生代謝物合成的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期從橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞的膠乳中分離到若干MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因。如HblMYC1、HblMYC2、HblMYC3、HblMYC4和HblMYC5基因等。這些基因?qū)Ω钅z、茉莉酸和乙烯處理反應(yīng)模式不盡相同，既表現(xiàn)出冗余性又有獨(dú)特的表達(dá)模式。其中HblMYC3基因能夠直接結(jié)合橡膠合成相關(guān)基因HbSRPP上游啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控該基因的表達(dá)，并且HblMYC3基因受割膠、茉莉酸和乙烯誘導(dǎo)表達(dá)[7]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HblMYC3基因在成齡高產(chǎn)品種中的表達(dá)量顯著地高于低產(chǎn)種質(zhì)[8]，這表明HblMYC3基因與橡膠產(chǎn)量相關(guān)。因此，研究HblMYC3基因參與對(duì)橡膠生物合成調(diào)控的分子機(jī)制具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前除了包杰[9]發(fā)現(xiàn)HblMYC3蛋白能夠與HblMYC1蛋白互作外，還未見(jiàn)利用酵母雙雜交技術(shù)高通量篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白報(bào)道。因此本研究擬通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，初步篩選與HblMYC3蛋白互作的蛋白，為進(jìn)一步研究茉莉酸信號(hào)途徑的調(diào)控機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

膠乳總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自于天根生化科技（北京）有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、快速限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自于Thermo ScientificTM公司；PCR克隆所需試劑2x PrimeSTAR Max premix、膠回收試劑盒購(gòu)自于寶生物工程大連有限公司；克隆載體pEASY-Blunt、大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB（北京）公司；酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)所用pGBKT7和pGADT7載體、Y2HGold酵母菌株及酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自于Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建酵母雙雜交pGBKT7-HblMYC3誘餌表達(dá)載體 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中HblMYC3基因（GenBank：HM347338）的編碼框序列設(shè)計(jì)分別帶有SfiⅠ和XmaⅠ酶切位點(diǎn)的載體構(gòu)建引物：SfiⅠ-HblMYC3-S：5′-CGGCCATGGAGGCCATGGAGGAG

ATAACGTCCCC-3，XmaⅠ-HblMYC3-A：5′-TCCCCGGGTCATAGGCTAGCAGCTAAGTTCTG-3′。載體構(gòu)建所需模板來(lái)自于橡膠樹(shù)膠乳RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，其提取和合成參照試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)方法。PCR反應(yīng)體系為：總體積20 μL，其中水 8 μL，2×PrimerSTAR Max permix 10 μL，正反向引物（10 μm/L）各0.5 μL， cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后切取正確條帶回收。純化的PCR回收產(chǎn)物與載體pEASY-Blunt在25 ℃連接20 min后，轉(zhuǎn)化50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞涂氨芐抗性平板置于37 ℃孵育過(guò)夜。利用載體通用引物M13F和M13R，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)鑒定陽(yáng)性克隆，送英駿公司測(cè)序鑒定正確后，提取pEASY-HblMYC3質(zhì)粒，用SfiⅠ和XmaⅠ進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為：總體積20 μL，其中水12 μL，pEASY-HblMYC3或pGBKT7質(zhì)粒4 μL，l0×digestion buffer 2 μL，SfiⅠ1 μL，XmaⅠ1 μL，37 ℃酶切反應(yīng)1 h。回收純化正確條帶，然后將膠回收片段SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ和酶切過(guò)的載體pGBKT7按照如下體系連接：水1 μL，SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ4 μL，pGBKT7 3 μL，10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化參照前述方法進(jìn)行。用載體構(gòu)建基因引物檢測(cè)陽(yáng)性克隆菌后，提取質(zhì)粒pGBKT7-HblMYC3，雙酶切鑒定插入片段大小，并送英俊公司測(cè)序鑒定。

1.2.2 pGBKT7-HblMYC3誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化主要參考訾亮等[10]的方法。

1.2.3 重組質(zhì)粒pGBKT7-HblMYC3自激活作用驗(yàn)證 將含有重組質(zhì)粒pGBKT7-HblMYC3的陽(yáng)性酵母菌和對(duì)照酵母菌分別接種于20 mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，檢測(cè)菌體濃度后統(tǒng)一調(diào)OD600至0.6左右，然后取4 μL 菌液分別滴加到SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade（添加顯色劑）的缺陷型平板上，30 ℃生長(zhǎng)3～6 d后記錄其生長(zhǎng)情況。同時(shí)為了確定后續(xù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)條件，本研究將空pGADT7-AD載體和pGBKT7-HblMYC3一起轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株，然后涂布SD/-Trp-Leu平板，參照上述自激活檢測(cè)方法將酵母菌點(diǎn)至SD/-Leu-Trp和SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加生長(zhǎng)抑制劑3-AT）平板上，記錄其生長(zhǎng)情況。

1.2.4 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用Clontech公司的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)試劑盒，參照PT4085-1說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行。橡膠樹(shù)膠乳材料采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州院區(qū)試驗(yàn)場(chǎng)種植的成年割膠樹(shù)熱研7-33-97。首先利用天根生化科技（北京）有限公司的植物RNA提取試劑盒提取膠乳樣品的總RNA后，取2 μL RNA樣品，1 μL CDSIII （Oligo-dT）引物和1 μL水置于72 ℃反應(yīng)2 min，然后置于冰上冷卻，再利用SMART MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈（反應(yīng)體系為2 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL DTT，1 μL dNTPs ，1 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，置于42 ℃反應(yīng)10 min后，接著添加1 μL SMART III-modified oligo置于42 ℃反應(yīng)60 min，75 ℃保溫2 min以終止第一鏈反應(yīng)，冷卻至室溫后，加入1 μL RNase H置于37 ℃反應(yīng)20 min。取2 μL First-stand SMART cDNA，70 μL ddH2O，10 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 3′PCR primer，2 μL 5′PCR primer，10 μL Melting Solution， 2 μL 50× Advantage 2 polymerase Mix共100 μL體系按照95 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)（95 ℃ 10 s，68 ℃ for 6 min，其中68 ℃延伸時(shí)間為每個(gè)循環(huán)增加5 s），68 ℃ for 5 min后得到雙鏈cDNA，經(jīng)過(guò)Clontech公司的Clontech CHROMA SPINTM TE-400 COLUMN柱子純化后溶于20 μL ddH2O中待用。然后將20 μL ds cDNA和6 μL 線(xiàn)性化的pGADT7-Rec載體利用LiAc轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Y187酵母菌株中，涂布于SD/-Leu平板上，于30 ℃培養(yǎng)3～4 d，用5 mL Freezing Medium充分重選每個(gè)SD/-Leu平板上的酵母菌，匯集所有酵母菌液后，利用Clontech公司的酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒備用。

1.2.5 文庫(kù)篩選和酵母雙雜交陽(yáng)性克隆的鑒定

在分析評(píng)價(jià)誘餌質(zhì)粒的自激活作用后，將誘餌載體pGBKT7-HblMYC3用于酵母雙雜交文庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)，方法參照MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System（PT4084-1）。將在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌斑重新挑至新鮮的SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加顯色劑）平板上繼續(xù)篩選，能連續(xù)生長(zhǎng)的菌即為候選的陽(yáng)性克隆菌，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性平板后得到陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒后經(jīng)載體測(cè)序引物T7和3′AD（Clontech公司）檢測(cè)后，送至測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比對(duì)獲取相應(yīng)候選基因的注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組pGBKT7-HblMYC3誘餌表達(dá)載體構(gòu)建與驗(yàn)證

以橡膠樹(shù)膠乳cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增HblMYC3基因的1 450 bp大小的編碼框（圖1-A）。擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收純化后，與pEASY-Blunt載體連接，通過(guò)載體引物PCR篩選陽(yáng)性克隆菌落，并檢測(cè)質(zhì)粒大小。用SfiⅠ和XmaⅠ雙酶切含有目的片段的質(zhì)粒，回收目的片段（圖1-A）。將目的片段與pGBKT7載體連接，構(gòu)建pGBKT7-HblMYC3重組載體，經(jīng)pGBKT7載體通用引物PCR檢測(cè)和雙酶切驗(yàn)證，插入片段大小與預(yù)期大小一致（圖1-B）。進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入目的片段的序列及其翻譯產(chǎn)生的蛋白序列的正確性。把pGBKT7-HblMYC3誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌中，經(jīng)pGBKT7載體通用引物PCR篩選陽(yáng)性菌落（圖1-C）。

2.2 pGBKT7-HblMYC3重組質(zhì)粒自激活檢測(cè)

含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌和含有空載體的酵母菌在SD/-Trp篩選平板上均能生長(zhǎng)，而且除了陽(yáng)性對(duì)照菌能夠在SD/-Trp-His-Ade篩選平板上很好的生長(zhǎng)外，陰性對(duì)照菌不能在該篩選平板上良好生長(zhǎng)，含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌生長(zhǎng)較慢，菌落很小，這些結(jié)果表明pGBKT7-HblMYC3重組質(zhì)粒自激活很弱，通過(guò)控制篩選條件可用于后續(xù)文庫(kù)篩選（圖2）。通過(guò)在SD/-Trp-His-Ade篩選平板上添加1mmol/L 3-AT生長(zhǎng)抑制劑能夠抑制pGBKT7-HblMYC3的酵母菌的背景生長(zhǎng)，而陽(yáng)性對(duì)照菌仍能正常良好生長(zhǎng)（圖2）。由此確定后續(xù)HblMYC3蛋白的酵母文庫(kù)篩選的條件：SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT （1 mmol/L）。

2.3 陽(yáng)性克隆的篩選和測(cè)序分析

經(jīng)過(guò)在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上篩選得到了7個(gè)酵母菌株。這些候選的酵母菌株接種到SD/-Trp-Leu和添加顯色劑的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。這些陽(yáng)性酵母菌都能不同程度地在篩選平板上生長(zhǎng)，同時(shí)其生長(zhǎng)情況和顯色程度的差異可能體現(xiàn)了候選蛋白與靶蛋白HblMYC3之間不同強(qiáng)度的結(jié)合能力。陽(yáng)性酵母菌中的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比對(duì)分析，結(jié)果表明候選蛋白分別為DNAJ分子伴侶/蛋白、參與活性氧清除的glutaredoxin2蛋白、轉(zhuǎn)錄因子LMYC1和LMYC2、ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白酶體相關(guān)蛋白，含zinc finger A20 and AN1 domain的脅迫相關(guān)蛋白、參與細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的28 ku熱、酸穩(wěn)定磷蛋白（表1）。

3 討論與結(jié)論

橡膠樹(shù)乳管是一種功能特化的組織，其主要功能是合成天然橡膠。天然橡膠主要在膠乳中的小橡膠粒子上合成[11]，而SRPP蛋白是小橡膠粒子中含量最豐富的蛋白[12]，參與了天然橡膠合成的調(diào)節(jié)。HblMYC3是從巴西橡膠樹(shù)的乳管細(xì)胞中分離鑒定到的MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達(dá)受割膠和茉莉酸上調(diào)。HblMYC3轉(zhuǎn)錄因子是SRPP基因表達(dá)的上游調(diào)控因子，它能直接結(jié)合SRPP基因的啟動(dòng)子，上調(diào)SRPP基因的表達(dá)[7]。因此推測(cè)HblMYC3基因是重要的參與橡膠生物合成調(diào)節(jié)的因子。本研究采用酵母雙雜交方法初步篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在進(jìn)一步了解HblMYC3的功能。酵母雙雜交技術(shù)是比較成熟和經(jīng)典的篩選靶蛋白的互作蛋白的方法，已經(jīng)成功應(yīng)用于橡膠樹(shù)分子生物學(xué)的研究中。例如，鄧治等[13]和楊子平等[14]分別利用該方法篩選到膠乳中與轉(zhuǎn)錄因子HbMyb1蛋白、HbRZF蛋白的互作蛋白；曾日中等[15]利用該方法篩選到膠乳中REF蛋白的互作蛋白。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧還蛋白2、含A20和 AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的脅迫相關(guān)蛋白5、28 ku熱、酸穩(wěn)定的磷蛋白以及25 ku泛素連接酶E2等7種蛋白，它們不同程度地與HblMYC3蛋白互作，推測(cè)HblMYC3可能與這些蛋白在膠乳中形成不同的復(fù)合體，參與不同的生物學(xué)過(guò)程。

DNAJ蛋白是重要的分子伴侶蛋白，對(duì)靶蛋白起保護(hù)作用，參與了植物對(duì)各種逆境脅迫的反應(yīng)[16-17]。橡膠生產(chǎn)中通過(guò)割膠收集膠乳，而割膠對(duì)橡膠樹(shù)而言是一種傷害脅迫。HblMYC3能夠被割膠處理誘導(dǎo)表達(dá)，表明HblMYC3參與了對(duì)這一逆境脅迫的反應(yīng)，而橡膠樹(shù)DNAJ蛋白能夠與HblMYC3蛋白互作，可能對(duì)保護(hù)HblMYC3蛋白有一定作用。

另外篩選到2個(gè)已經(jīng)報(bào)道的橡膠樹(shù)膠乳轉(zhuǎn)錄因子HblMYC1（或LMYC1）和HblMYC2（或LMYC2）。HblMYC1和HblMYC2基因與HblMYC3基因同屬于MYC亞類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子成員[7]。它們能夠被割膠脅迫和茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)[18]，但兩者的表達(dá)模式相反。HblMYC1和HblMYC2基因不能夠直接結(jié)合SRPP基因的上游啟動(dòng)子（1 103 bp）[7]。因此，HblMYC1或HblMYC2蛋白可能通過(guò)與HblMYC3蛋白形成異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體參與調(diào)控SRPP基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室曾利用點(diǎn)對(duì)點(diǎn)酵母雙雜交證明HblMYC3蛋白與HblMYC1蛋白的相互作用[9]。

Glutaredoxin為谷氧還蛋白，參與活性氧的清除，其作用與硫氧還蛋白（Thioredoxin）類(lèi)似[19]。HblMYC3與glutaredoxin蛋白之間的相互作用可能暗示HblMYC3蛋白參與了膠乳中的抗氧化過(guò)程。同時(shí)HblMYC3與ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白之間的相互作用表明HblMYC3蛋白同樣經(jīng)由泛素連接酶E2介導(dǎo)的泛素化降解過(guò)程。

基于這些互作蛋白的功能，推測(cè)HblMYC1或HblMYC2通過(guò)與HblMYC3形成二聚體調(diào)控小橡膠粒子膜蛋白基因表達(dá)，其他蛋白參與脅迫條件下維持該二聚體的穩(wěn)定性和脅迫反應(yīng)后降解該蛋白。

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