木薯MeGWD3基因克隆及植物表達載體構(gòu)建

付莉莉 韓冰瑩 譚德冠 孫雪飄 張家明

摘要：【目的】克隆木薯葡聚糖水合雙激酶（MeGWD3）基因并構(gòu)建其植物表達載體，為開展木薯MeGWD3基因調(diào)控及功能研究提供參考。【方法】采用RT-PCR從木薯華南124（SC124）中克隆MeGWD3基因，對其進行序列分析，并將其連接至改造的pCAMBIA2300載體，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3?！窘Y(jié)果】MeGWD3基因全長3522 bp，編碼1173個氨基酸。經(jīng)序列比對，發(fā)現(xiàn)MeGWD3基因序列與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中公布的GWD基因（cassava4.1_000497m）只存在2個堿基差異，同源性高達99.94%；與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的木薯GWD基因（JN618460）同源性高達99.00%，與蓖麻GWD基因（XM_002518566）同源性達86.00%；成功構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3。【結(jié)論】成功構(gòu)建的植物表達載體pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代謝研究。

關(guān)鍵詞： 木薯；葡聚糖水合雙激酶；克??；植物表達載體

中圖分類號： S533 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1057-07

0 引言

【研究意義】植物淀粉是食品和工業(yè)應(yīng)用中重要的原材料之一。木薯（Manihot esculenta）塊根淀粉含量極高，被譽為淀粉之王。淀粉磷酸化是淀粉代謝的一個重要機制，由一系列酶促反應(yīng)調(diào)控。葡聚糖水合雙激酶（Glucan water dikinase，GWD）是淀粉磷酸化作用酶，在淀粉代謝中起關(guān)鍵作用。此外，近年來的研究結(jié)果表明，GWD基因還與抗逆和光周期等密切相關(guān)（Reimann et al.，2002；Yano et al.，2005；Hejazi et al.，2014）。因此，進行木薯GWD基因克隆及其表達載體構(gòu)建對開展木薯MeGWD3基因調(diào)控及功能研究具有重要意義。【前人研究進展】Lorberth等（1998）最早發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉顆粒中存在一種R1蛋白，其含量與淀粉磷酸化程度高度相關(guān)，該蛋白被確認(rèn)為GWD。Yu等（2001）發(fā)現(xiàn)GWD基因突變會導(dǎo)致淀粉磷酸化受阻，從而使淀粉降解困難。Nielsen等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中過量表達GWD，導(dǎo)致糖原磷酸化程度提高了6倍。Theerawitaya等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，水稻GWD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與鹽脅迫相關(guān)，其機制是通過磷酸化淀粉，加快淀粉在凍害前被淀粉酶降解為可溶性糖的速度。Hejazi等（2014）根據(jù)擬南芥野生型和GWD突變體對不同光周期反應(yīng)，證明GWD基因與光周期密切相關(guān)，在淀粉代謝過程起重要作用。Skeffington等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，超表達GWD基因未加速擬南芥葉片淀粉的降解，直到其表達水平下降70%后，淀粉降解和合成均被抑制。目前，關(guān)于木薯淀粉的研究報道主要集中在淀粉結(jié)構(gòu)與性質(zhì)方面（趙奕玲等，2007；古碧等，2009；安飛飛等，2015），被研究的淀粉代謝相關(guān)基因主要有SBE、AGPase、GBSS等（許娟等，2012；郭運玲等，2013；陳會鮮，2014；郭雅靜等，2014；劉平平等，2015）。【本研究切入點】有關(guān)木薯GWD基因的研究未見報道，其生物學(xué)功能也尚未清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以木薯為材料，利用RT-PCR克隆MeGWD3基因片段并進行序列分析，將其連接至改造的pCAMBIA2300載體，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3，為進一步開展MeGWD3調(diào)控及基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為木薯品種華南124（SC124），種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗田。大腸桿菌DH5α購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；改造的pCAMBIA2300載體由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所實驗室保存提供；pMD19-T載體、T4連接酶、DNaseI、DNA Polymerase購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和限制性內(nèi)切酶購自加拿大Fermentas公司；Plant RNA Reagent試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設(shè)計 根據(jù)木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava）中公布的GWD基因（cassava4.1_000497m）序列，采用Primer 5.0設(shè)計引物，由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。為了方便后續(xù)植物表達載體的構(gòu)建，在正向引物FGWDF4（5'-GGGGTACCATGGATTCTCTGCGTGTATTG-3'）插入KpnⅠ酶切位點（下劃線處），反向引物FG

WDR4（FGWDR4：5'-CGGGATCCCTATGGTTGTGG

GCGTGTC-3'）插入BamHⅠ酶切位點（下劃線處），并加上保護堿基。這2個酶切位點是pCAMBIA2300載體的多克隆位點，但在MeGWD3基因序列上不存在。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 取新鮮的木薯葉片1.0 g，液氮研磨，根據(jù)Plant RNA Reagent試劑盒說明提取總RNA，生物分析儀Agilent 2100測定RNA濃度為395 ng/μL，-80 ℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1. 2. 3 基因克隆及序列分析 以木薯葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系（50.0 μL）：cDNA模板1.0 μL，10×LA Taq Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，5 U/μL LA Taq酶0.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O 37.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 3.5 min，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，25 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段與TA克隆載體pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR驗證后，選擇陽性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測序。利用NCBI-BLAST對獲得的目的片段進行同源性比對，并利用在線軟件（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）進行蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，最后利用MEGA 6.0構(gòu)建MeGWD3基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 植物表達載體構(gòu)建及陽性克隆篩選 將重組質(zhì)粒pMD19-T-MeGWD3和pCAMBIA2300載體分別用KpnⅠ和BamHⅠ進行雙酶切。酶切體系（20.0 μL）：質(zhì)粒10.0 μL，10×Fast Digest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和BamHⅠ各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL，于37 ℃反應(yīng)3～4 h。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的條帶，將其與pCAMBIA2300載體用T4連接酶于16 ℃連接過夜，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選陽性克隆并進行PCR擴增、雙酶切及測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 木薯總RNA提取結(jié)果

木薯葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）表明，RNA完整性較好，可用于后續(xù)試驗。

2. 2 MeGWD3基因克隆結(jié)果

將提取的木薯葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得1條約3500 bp的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。將目的片段切膠回收，回收產(chǎn)物與TA克隆載體pMD19-T連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR（圖3）和雙酶切（圖4）驗證，結(jié)果表明已成功克隆獲得MeGWD3基因。

2. 3 MeGWD3基因序列分析結(jié)果

MeGWD3基因測序結(jié)果如圖5所示，該基因含有一個完整的開放閱讀框，長度為3522 bp，編碼1173個氨基酸。BLAST結(jié)果表明，MeGWD3與NCBI中公布的木薯GWD基因（JN618460）同源性高達99.00%，與蓖麻GWD基因（XM_002518566）同源性達86.00%，與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中公布的GWD基因（cassava 4.1_000497m）只存在2個堿基差異，同源性高達99.94%，進一步證明已成功克隆MeGWD3基因。

為了解MeGWD3與其他植物GWD基因的進化關(guān)系，利用MEGA 6.0構(gòu)建不同植物GWD基因的系統(tǒng)進化樹。由圖6可知，MeGWD3與蓖麻（Ricinus communis）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）、楊樹（Populus euphratica）的GWD基因親緣關(guān)系較近，而與油菜（Brassica napus）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的GWD基因親緣關(guān)系較遠。

2. 3 植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3構(gòu)建

用KpnⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pCAMBIA2300載體和重組質(zhì)粒pMD19-T-MeGWD3后，將MeGWD3基因連接至pCAMBIA2300載體上（圖7），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR（圖8）、雙酶切（圖9）及測序驗證，結(jié)果表明已成功構(gòu)建獲得植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3。

3 討論

GWD在淀粉代謝中起催化淀粉磷酸化的作用（謝淑蓉和浦躍武，2005；孫瀟和包勁松，2014）。GWD基因最早是在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)含量與淀粉磷酸化程度高度相關(guān)（Lorberth et al.， 1998）。隨后，GWD基因從擬南芥（Kaplan and Guy， 2005）、小麥（Ral et al.， 2012）和水稻（Boriboonkaset et al.， 2013）等不同物種中克隆獲得并對其功能開展了研究。序列分析結(jié)果表明，擬南芥和馬鈴薯的GWD基因序列具有較高的保守性，氨基酸序列相似性達79.00%（Hejazi et al.， 2012）。本研究采用RT-PCR從木薯SC124中成功克隆MeGWD3基因，長度為3522 bp，編碼1173個氨基酸，其序列比對分析結(jié)果表明，MeGWD3基因與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中參考基因的序列同源性高達99.94%，二者間僅存在2個堿基差異，可能是木薯品種間的差異造成的。系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果表明，MeGWD3與蓖麻GWD基因（XM_002518566）的同源性最高，達86.00%。

隨著RNAi、超表達等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，研究者對GWD基因的功能有了更進一步的認(rèn)識。如利用反義技術(shù)可抑制馬鈴薯GWD基因表達，而導(dǎo)致淀粉結(jié)合磷酸鹽減少90%（Lorberth et al.， 1998）；過量表達GWD基因可使糖原磷酸化程度顯著增加（Nielsen et al.， 2002）。通過RNAi技術(shù)下調(diào)GWD基因的表達可增加小麥籽粒生物量（Ral et al.， 2012）。由此可見，構(gòu)建目的基因表達載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究目的基因的功能，已成為常規(guī)的分子生物學(xué)方法。本研究利用雙酶切法將MeGWD3基因片段與pCAMBIA2300載體連接，成功構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300- MeGWD3，可為下一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究MeGWD3基因功能打下基礎(chǔ)。

此外，研究目的基因在多種脅迫條件下的表達差異也是常見的基因功能分析手段之一。如在鹽和凍害脅迫下GWD基因的表達量均增加（Kaplan and Guy，2005；Boriboonkaset et al.，2013），據(jù)此推測GWD基因具有耐鹽和抗凍害的功能。但本研究尚未涉及MeGWD3基因表達的分析，因此，MeGWD3基因?qū)Ω鞣N脅迫條件的響應(yīng)有待進一步探究。

4 結(jié)論

根據(jù)木薯數(shù)據(jù)庫已知的GWD基因序列，采用RT-PCR從木薯SC124中成功克隆獲得MeGWD3基因，其cDNA全長3522 bp，編碼1173個氨基酸，將其與pCAMBIA2300載體連接，可成功構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300-MeGWD3，為進一步研究該基因的功能及木薯淀粉代謝打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）