DEHP脅迫對高/低累積鄰苯二甲酸酯品種水稻抗氧化酶系統(tǒng)的影響

陳意良 魯磊安 莫測輝 蔡全英

摘 要 以前期篩選獲得的鄰苯二甲酸酯（PAEs）高/低累積基因型水稻（Oryza sativa L.）品種（培雜泰豐/豐優(yōu)絲苗）進(jìn)行土培試驗(yàn)，對比研究鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）污染脅迫下2個品種水稻體內(nèi)過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性及丙二醛（MDA）含量變化，以揭示DEHP脅迫下2個品種的生理生化和DEHP累積差異。結(jié)果顯示，2個品種水稻體內(nèi)DEHP含量隨土壤污染濃度增加而增加，但生物量下降，而且培雜泰豐地上部的生物量敏感性響應(yīng)指數(shù)和DEHP含量比豐優(yōu)絲苗的高，說明前者對DEHP的耐受性更強(qiáng)。2個品種水稻體內(nèi)丙二醛含量基本保持不變，但過氧化物酶和多酚氧化酶活性則隨土壤DEHP濃度的增加而升高，說明水稻可能通過提高過氧化物酶和多酚氧化酶活性以降低DEHP脅迫。豐優(yōu)絲苗的多酚氧化酶活性較培雜泰豐的高，可能影響到DEHP在水稻體內(nèi)降解進(jìn)而導(dǎo)致前者體內(nèi)DEHP含量較低。

關(guān)鍵詞 鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；水稻；多酚氧化酶；過氧化物酶；丙二醛

中圖分類號 S511；X173 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Two different genotypic cultivars of rice（Oryza sativa L.）with PAE（phthalic acid esters）high-accumulation（cultivar Peizataifeng）and low-accumulation（cultivar Fengyousimiao）were grown in soil spiked with di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP， 0， 50， and 100 mg/kg）. The peroxidase（POD）and polyphenol oxidase（PPO）activities， malondialdehyde（MDA）content were measured to reveal the difference in DEHP accumulation， physiology and biochemistry changes between Peizataifeng and Fengyousimiao. The results indicated that DEHP concentrations in rice plants increased while the biomass of rice decreased with increasing concentrations of DEHP in the soil. The index of biomass response to stress of Peizataifeng was higher than that of Fengyousimiao， indicating that Peizataifeng was more tolerant to DEHP than Fengyousimiao. The MDA contents of the two cultivars kept unchanged while the activities of PPO and POD increased with increasing concentrations of DEHP in the soil. These results illustrated that the rice might alleviate DEHP stress by elevating the activities of PPO and POD. The PPO activity of Fengyousimiao was higher than that of Peizataifeng， which might affect the in-vivo degradation of DEHP， and thus led to a lower DEHP concentration in Fengyousimiao than Peizataifeng.

Key words Di（2-ethylhexyl）phthalate； Rice； Peroxidase； Polyphenol oxidase； Malondialdehyde

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.007

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中地膜覆蓋和塑料大棚的廣泛應(yīng)用，2014年中國農(nóng)用塑料薄膜使用量達(dá)258萬t（地膜使用量為144萬t）[1]，約20%的地膜殘留在土壤中[2]。其中，鄰苯二甲酸酯（PAEs，俗稱塑化劑）在塑料中含量可達(dá)40%～60%[3]，地膜殘留，加上大量施用化肥農(nóng)藥及“三廢”污染，導(dǎo)致土壤PAEs含量上升。有研究發(fā)現(xiàn)，全國農(nóng)業(yè)土壤PAEs含量以廣東最高，部分高達(dá)幾個到幾十個mg/kg[4-5]。而且廣東地區(qū)不同類型農(nóng)業(yè)土壤中PAEs含量以水田的最高，其中以鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）檢出最普遍且含量最高[6]。PAEs尤其是長鏈的DEHP屬于典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，DEHP具有潛在“三致”毒性，被美國環(huán)保局（USEPA）列為“優(yōu)控污染物”。

殘留在土壤中的DEHP會通過根系吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，影響植物生長及生理生化功能[7-8]。作者前期研究結(jié)果表明，低濃度DEHP處理會促進(jìn)大部分品種菜心生長（生物量增加），而高濃度處理則有明顯的抑制作用[8]。植物體內(nèi)的生理生化過程是植物吸收累積外源污染物的內(nèi)在調(diào)節(jié)因素[9]，特別是植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)對植物應(yīng)對污染物脅迫的能力至關(guān)重要。其中，多酚氧化酶（PPO）被認(rèn)為在植物體內(nèi)可降解環(huán)狀化合物[10]，是與植物體內(nèi)防御系統(tǒng)有關(guān)的重要蛋白質(zhì)[11]。植物會提高體內(nèi)PPO活性來應(yīng)對受到的生物或者非生物性脅迫[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，PAEs脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，可能會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和酶失活等[14]。丙二醛作為細(xì)胞內(nèi)膜脂過氧化或脫脂的產(chǎn)物，其含量的多少可以代表膜損傷程度的大小。過氧化物酶（POD）是一種重要的保護(hù)酶，能清除植物體內(nèi)多余的活性氧自由基，抑制膜脂的過氧化進(jìn)程[15]，從而保護(hù)植物生理活動的正常進(jìn)行以應(yīng)對外源污染物的脅迫。

外源污染脅迫下不同植物體內(nèi)酶系統(tǒng)的反應(yīng)不一樣，進(jìn)而影響到污染物對植物的毒理效應(yīng)以及污染物在體內(nèi)的降解，最終表現(xiàn)為不同植物對污染物的吸收累積差異[8，16]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，不同品種水稻對DEHP的吸收累積存在差異[16]，其根系形態(tài)和根系分泌物等也存在品種差異[17]。但DEHP脅迫下不同品種水稻的酶活性變化尚未清楚。本研究以前期篩選獲得的高/低累積PAEs水稻品種培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗為供試植物[17]，研究DEHP污染脅迫下2種水稻體內(nèi)的多酚氧化酶、過氧化物酶活性以及丙二醛含量的變化規(guī)律，為揭示其累積差異機(jī)理和保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DEHP（AR）購自阿拉?。ㄉ虾９荆?。培雜泰豐種子購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，豐優(yōu)絲苗種子購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。水稻土取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場田間0～20 cm的耕作層，采集后于室內(nèi)風(fēng)干、粉碎過5 mm篩備用。水稻土DEHP背景值0.71 mg/kg，pH5.59，有機(jī)質(zhì)30.2 g/kg，CEC 7.67 cmol/kg，全氮1.26 g/kg、全磷1.79 g/kg和全鉀18.0 g/kg，粒徑組成：砂粒52.0%，粉粒41.9%，粘粒6.1%。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)方法 采用培雜泰豐（PAEs高累積）和豐優(yōu)絲苗（PAEs低累積）進(jìn)行土壤培養(yǎng)試驗(yàn)。設(shè)置空白、低濃度、高濃度3個處理。采用人工配制污染土壤，即量取一定量的DEHP溶于丙酮（AR），添加到水稻土（過1 mm篩）中，混勻，放置暗處讓丙酮自然揮發(fā)3 d（中途不斷攪拌使丙酮盡快揮發(fā)），制得DEHP含量為500 mg/kg和1 000 mg/kg的污染土壤。按污染土壤與未污染土壤1 ∶ 9的比例進(jìn)行攪拌混勻，制得盆栽污染土壤（DEHP含量為50 mg/kg（低濃度）和100 mg/kg（高濃度）。以不添加DEHP的土壤為對照處理（CK）。每個處理3個重復(fù)，采用隨機(jī)排列。

將豐優(yōu)絲苗和培雜泰豐2個品種的種子分別用15%的過氧化氫消毒10 min，然后將消毒過的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于生化培養(yǎng)箱中催芽24 h。將催芽后的種子撒在鋪滿基質(zhì)的育苗板上，待水稻苗長至4～5片葉子時進(jìn)行移苗。移苗后，每天澆水保持土壤呈淹水狀態(tài)，并不定期添加營養(yǎng)液保證水稻正常生長。待長到45 d的時候，采集水稻根系和地上部樣品。分別測定生物量、DEHP含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性及丙二醛含量。

1.2.2 DEHP含量測定 植物樣品采用二氯甲烷（色譜純）超聲提取，方法參考 USEPA 3500b[16]并適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱量粉碎后的植物樣品（地上部1.0 g，地下部0.5 g）于50 mL玻璃離心管中。加入20 mL二氯甲烷超聲提取10 min，3 300 r/min離心分離（重復(fù)3次），將上述上清液合并后過硅膠柱凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞榮RE-52A，上海）濃縮，氮吹儀吹干后定容，4 ℃保存待測。待測液中DEHP采用氣相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)（GC-MS）分析，參考 USEPA 8270C 方法[17]并適當(dāng)修改。GC-MS 聯(lián)用儀型號為 GC-MSQP2010（島津，日本），色譜柱為Rxi-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He）。質(zhì)譜儀采用電子轟擊源（EI）。采用 DEHP 化合物標(biāo)樣的0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L為工作曲線。DEHP回收率為88.03%～100.3%。水稻體內(nèi)DEHP含量以干重計。

1.2.3 植物酶活性的測定 采用分光光度法測定PPO、POD活性和MDA含量，具體的測定方法參照Ma等[18]的方法。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，SPSS進(jìn)行統(tǒng)計分析。

為了比較培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗對PAEs污染脅迫的反應(yīng)，按照下列公式計算生物量敏感性響應(yīng)指數(shù)（BRS）[19]：

BRS/%=（BH-BL）/BL×100 BH（g）、BL（g）分別是高濃度處理和低濃度處理的生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP脅迫對水稻生物量的影響

由圖1可以看出，培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗的地上部和地下部的生物量均隨著DEHP濃度的增大而減小，說明50 mg/kg DEHP會抑制2種水稻的生長。而且，培雜泰豐地上部的生物量敏感性響應(yīng)指數(shù)比豐優(yōu)絲苗大，且差異顯著（p<0.05）（表1），說明豐優(yōu)絲苗對DEHP脅迫比培雜泰豐更為敏感。

2.2 水稻體中DEHP含量

隨著DEHP濃度的升高，培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗的地上部和地下部DEHP的含量均增加，且不同處理水平之間差異極顯著（表2），說明水稻體對DEHP有累積效應(yīng)。但2個品種水稻地上部的DEHP含量比同等污染水平下（100 mg/kg）的菜心地上部DEHP含量顯著低[8]，說明水稻地上部較菜心累積DEHP少。同一處理地下部與地上部相比，前者DEHP含量較高，即DEHP在水稻體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)小于1，說明DEHP更易被根系累積或滯留。經(jīng)雙因素方差分析，品種間地上部DEHP含量差異顯著，地下部無顯著差異（表2），驗(yàn)證了培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗分別是高、低累積DEHP的水稻品種。

2.3 水稻體酶活性

2.3.1 過氧化物酶活性 過氧化物酶（POD）是植物抗氧化酶系統(tǒng)中的一種重要保護(hù)酶，能清除機(jī)體內(nèi)活性氧自由基，有利于植物維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和淬滅的動態(tài)平衡，從而抑制膜脂過氧化的進(jìn)程。如圖2所示，培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗地上部的POD活性均隨著DEHP濃度的升高而升高。經(jīng)雙因素方差分析表明（表3），培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗2個品種的多酚氧化酶活性無顯著差異，但二者地上部的DEHP含量差異極顯著，這說明不同品種水稻對DEHP脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的閾值不同，培雜泰豐比豐優(yōu)絲苗更耐受DEHP脅迫。

2.3.2 多酚氧化酶活性 多酚氧化酶（PPO）是一種存在于多種真菌和植物組織內(nèi)、能夠促進(jìn)酚類化合物氧化的一類酶的通稱[20]。圖3可知，隨著土壤DEHP濃度的升高，PPO活性整體呈上升趨勢，與植物中DEHP含量變化規(guī)律一致（表1）。說明高濃度DEHP處理會激活PPO，從而保護(hù)植物不受DEHP毒害。經(jīng)雙因素方差分析可知（表3），不同濃度、不同品種之間PPO活性差異極顯著。

2.3.3 丙二醛含量 植物受到外源污染物入侵時，會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，其易使植物細(xì)胞內(nèi)膜發(fā)生過氧化作用或脫脂作用，丙二醛（MDA）作為細(xì)胞內(nèi)膜脂過氧化或脫脂的產(chǎn)物，其含量的多少可以代表膜損傷程度的大小[15]。由圖4可以看到，低DEHP處理培雜泰豐的MDA含量顯著高于其對照，濃度增加后MDA含量下降；而豐優(yōu)絲苗各處理間MDA含量無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

生物量被認(rèn)為是植物受到污染物毒害最好的指示物[21]。污染物對植物生物量的影響與其濃度、植物種類以及生長期等有關(guān)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度DEHP或DBP處理促進(jìn)植物生長，高濃度則抑制生長[8，13]。本研究中DEHP處理的生物量均比空白對照的低，說明DEHP脅迫抑制水稻生長。當(dāng)植物受到DEHP脅迫時，會激發(fā)植物自身的防御體系，誘導(dǎo)POD活性增大以應(yīng)對DEHP脅迫導(dǎo)致的體內(nèi)氧自由基增加。類似的，有研究發(fā)現(xiàn)DBP和DEHP脅迫下綠豆POD活性隨著污染物濃度的增大而呈現(xiàn)上升趨勢，但達(dá)到最大值后，隨污染物濃度增大POD活性降低。這可能由于高濃度污染下產(chǎn)生的自由基數(shù)量超出了POD的清除能力而對植物造成傷害[13，23]。這說明POD活性存在一個閾值，對植物的保護(hù)作用存在一定的限度。本研究中POD活性一直保持上升的趨勢，可能是因?yàn)楸狙芯克倔w內(nèi)DEHP產(chǎn)生的自由基數(shù)量尚未超出POD的清除能力。

當(dāng)植物吸收外源污染物后，體內(nèi)的一些特定酶如酚氧化酶、氧化物酶、P450單加氧酶等，能對體內(nèi)的外源污染物進(jìn)行轉(zhuǎn)化/代謝[24-25]。例如，Gong等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PPO主導(dǎo)了高羊茅（Festuca Arundinacea）體內(nèi)多環(huán)芳烴的降解。本研究中，低濃度DEHP處理下培雜泰豐的PPO活性與對照間差異不顯著，而豐優(yōu)絲苗的PPO活性顯著高于其對照，這可能是因?yàn)椴煌贩N水稻對DEHP脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)不同[22]。同一DEHP水平下，豐優(yōu)絲苗的PPO活性顯著高于培雜泰豐的，可能影響水稻體內(nèi)DEHP的降解進(jìn)而導(dǎo)致前者體內(nèi)DEHP含量較低。

2個品種水稻體內(nèi)丙二醛含量基本保持不變（圖4），但其過氧化物酶和多酚氧化酶活性則隨DEHP濃度的增加而升高。這可能是因?yàn)樗臼艿紻EHP脅迫導(dǎo)致其體內(nèi)活性氧自由基增加，地上部出現(xiàn)應(yīng)激防御，提高POD和PPO活性，及時清除植物體內(nèi)多余的活性氧自由基并降解DEHP，從而使MDA含量保持穩(wěn)定，但具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 結(jié)論

DEHP脅迫下，培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗生物量均隨著DEHP濃度的升高而降低，說明50 mg/kg DEHP會抑制2種水稻的生長。培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗體內(nèi)的DEHP含量均隨著DEHP濃度的升高而升高，說明2種水稻對DEHP均有累積效應(yīng)，且DEHP更易被根系累積或滯留。

DEHP脅迫下，培雜泰豐和豐優(yōu)絲苗體內(nèi)的MDA含量基本保持不變，但POD和PPO活性均升高。豐優(yōu)絲苗和培雜泰豐的POD和PPO活性變化規(guī)律不同，前者的POD活性比后者的高，可能影響到DEHP在水稻體內(nèi)降解進(jìn)而導(dǎo)致前者體內(nèi)DEHP含量較低。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家統(tǒng)計局農(nóng)村社會經(jīng)濟(jì)調(diào)查司. 中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒[M]. 北京： 中國統(tǒng)計出版社， 2015： 41.

[2] 中國環(huán)境保護(hù)部. 第一次全國污染源普查公報[R]. 2010： 10.

[3] Mo C H， Cai Q Y， Zeng Q Y. Occurrence of priority organic pollutants in the fertilizers， China[J]. Journal of Hazardous Materials， 2008， 152（3）： 1 208-1 213.

[4] Cai Q Y， Mo C H， Wu Q T， et al. The status of soil contamination by semivolatile organic chemicals（SVOCs）in China： A review[J]. Science of the Total Environment， 2008， 389（2-3）： 209-224.

[5] Niu L L， Xu Y， Xu C， et al. Status of phthalate esters contamination in agricultural soils across China and associated health risks[J]. Environmental Pollution， 2014， 195： 16-23.

[6] 楊國義， 張?zhí)毂颍?高淑濤， 等. 廣東省典型區(qū)域農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯的分布特征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2007， 18（10）： 2 308-2 312.

[7] Zhao H M， Du H， Xiang L， et al. Physiological differences in response to di-n-butyl phthalate（DBP）exposure between low- and high-DBP accumulating cultivars of Chinese flowering cabbage （Brassica parachinensis L.）[J]. Environmental Pollution， 2016， 208： 840-849.

[8] Zhao H M， Du H， Xiang L， et al. Variations in phthalate ester （PAE）accumulation and their formation mechanism in Chinese flowering cabbage（Brassica parachinensis L.）cultivars grown on PAE-contaminated soils[J]. Environmental Pollution， 2015， 206： 95-103.

[9] Ma T T， Christie P， Luo Y M， et al. Physiological and antioxidant responses of germinating Mung Bean seedlings to phthalate esters in soil[J]. Pedosphere， 2014， 24（1）： 107-115.

[9] Mostofa M G， Hossain M A， Fujita M， et al. Physiological and biochemical mechanisms associated with trehalose-induced copper-stress tolerance in rice[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 11 433.

[10] Edwards W， Bownes R， Leukes W D， et al. A capillary membrane bioreactor using immobilized polyphenol oxidase for the removal of phenols from industrial effluents[J]. Enzyme and Microbial Technology， 1999， 24： 209-217.

[11] Constabel C P， Bergey D R， Ryan C A. System in activates synthesis of wound-inducible tomato leaf polyphenol oxidase via the octadecanoid defense signaling pathway[J]. PNAS， 1995， 92： 407-411.

[12] Kwak S S， Kim S K， Park I H， et al. Enhancement of peroxidase activity by stressed-related chemicals in sweet potato[J]. Phytochemical Analysis， 1996， 43： 565-568.

[13] Ma T T， Christie P， Teng Y， et al. Rape（Brassica chinensis L.）seed germination， seedling growth， and physiology in soil polluted with di-n-butyl phthalate and bis（2-ethylhexyl）phthalate[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2013， 20： 5 289-5 298.

[14] Winston G W. Oxidants and antioxidants in aquatic animals[J]. Comparative Biochemistry and Physiology， 1991， 100： 173-176.

[15] 嚴(yán)重玲， 洪業(yè)湯， 付舜珍， 等. Cd、Pb脅迫對煙草葉片中活性氧清除系統(tǒng)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報， 1997， 17（5）： 488-492.

[16] Cai Q Y， Xiao P Y， Chen T， et al. Genotypic variation in the uptake， accumulation， and translocation of of di-（2-ethylhexyl） phthalate by twenty cultivars of rice（Oryza sativa L.）[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2015， 116： 50-58.

[17] 陳桐， 蔡全英， 吳啟堂， 等. PAEs脅迫對高/低累積品種水稻根系形態(tài)及根系分泌低分子有機(jī)酸的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報， 2015， 24（3）： 494-500.

[18] Ma T T， Christie P， Luo Y M， et al. Physiological and antioxidant responses of germinating Mung Bean seedlings to phthalate esters in soil[J]. Pedosphere， 2014， 24（1）： 107-115.

[19] Wang J， Yuan J， Yang Z， et al. Variation in cadmium accumulation among 30 cultivars and cadmium subcellular distribution in 2 selected cultivars of water spinach（Ipomoea aquatica Forsk.）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009， 57： 8 942-8 949.

[20] John K S， Bhat S G， Rao UJSP， et al. Isolation and partial characterization of phenol oxidases from Mangifera indica L. sap（latex）[J]. Journal of molecular catalysis B-enzymatic， 2011， 68： 30-36.

[21] Shi G R， Cai Q S. Cadmium tolerance and accumulation in eight potential energy crops[J]. Biotechnology Advances， 2009， 27： 555-561.

[22] Xin J， Huang B， Liu A， et al. Identification of hot pepper cultivars containing low Cd levels after growing on contaminated soil： uptake and redistribution to the edible plant parts[J]. Plant soil， 2013， 373： 415-425.

[23] Liu W L， Zhang C B ， Liu S Y. Effects of phthalate ester treatment on seed germination and antioxidant enzyme activities of Phaseolus radiatus L[J]. Bulletin of Environment Contamination and Toxicology， 2014， 92： 621-624.

[24] Kvesitadze E， Sadunishvili T， Kvesitadze G. Mechanisms of organic contaminant uptake and degradation in plants[J]. World Acad Sci Eng Technol， 2009， 55： 458-468.

[25] Schroder P. Phytoremediation： Methods and reviews[M]. Totowa： Humana Press， 2007： 251-263.

[26] Gong S S， Han J， Gao Y Z， et al. Effects of inhibitor and safener on enzyme activity and phenanthrene metabolism in root of tall fescue[J]. Acta Ecologica Sinica， 2011， 31： 4 027-4 033.