海南島益智種質(zhì)資源表型變異及ISSR分析

王祝年 邱燕連 晏小霞 陳永鋒 葉才華

摘 要 對海南島72份益智種質(zhì)的遺傳多樣性進行系統(tǒng)評價。利用相關(guān)分析、主成分分析探究各表型性狀的相互關(guān)系，結(jié)合表型性狀及ISSR標記研究資源的遺傳多樣性。結(jié)果表明：不同益智種質(zhì)的各種性狀均存在變異，所調(diào)查的14個性狀可歸類為營養(yǎng)器官、產(chǎn)量、果實形態(tài)等3個部分，各部分平均變異系數(shù)表現(xiàn)為CV產(chǎn)量（0.464）>CV營養(yǎng)器官（0.143）>CV果實形態(tài)（0.121）。性狀相關(guān)分析中，91對性狀組合中有34對呈極顯著相關(guān)。主成分分析前7個主成分積累貢獻率達到89.29%，前3個貢獻率最大的主成分積累貢獻率達到64.86%，單果體積因子第一，產(chǎn)量因子第二，單果形態(tài)因子第三。經(jīng)基于表型性狀的聚類分析，72份樣本可分為9組。利用20條ISSR引物對68份益智種質(zhì)材料基因組DNA進行研究，共擴增出466條條帶，其中446條為多態(tài)性帶，占總條帶的95.71%；當相似系數(shù)為0.762時，68份樣本被分為6組，其中42.65%的樣品被分到第Ⅲ組。依據(jù)ISSR標記的聚類與表型性狀的表現(xiàn)并不完全一致，這可能是由于DNA結(jié)構(gòu)差異不一定在表型性狀上得到相應(yīng)表現(xiàn)，本研究所調(diào)查的表型性狀只是益智表型性狀的一部分，而ISSR標記所分析的位點則覆蓋整個基因組。

關(guān)鍵詞 海南島；益智；表型性狀；ISSR；聚類分析

中圖分類號 Q949.71+8.33 文獻標識碼 A

益智（Alpinia oxyphylla Miquel）屬姜科山姜屬植物，為中國四大南藥之一，主產(chǎn)于中國海南，廣東、云南、廣西、福建亦有少量栽培。益智以干燥成熟果實入藥，已有悠久的藥用歷史，其性溫味辛，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功能[1]。此外，益智還是極有開發(fā)價值的香料植物，已被廣泛應(yīng)用于保健食品和藥膳等，屬藥、香、食同源植物，具有廣泛的研究和應(yīng)用價值，已開發(fā)出系列產(chǎn)品。

近年來，學(xué)者們陸續(xù)對益智進行了相關(guān)研究，取得了很大的進展，研究范圍包括化學(xué)成分[2-4]、藥理[5-7]、栽培技術(shù)[8]、組織培養(yǎng)[9]、遺傳多樣性[10-11]、食品開發(fā)[12-14]等多方面的內(nèi)容，但關(guān)于益智遺傳育種方面的研究尚未見報道。海南島益智主要為農(nóng)戶自發(fā)引種栽培，各地間種質(zhì)資源交流頻繁，遺傳變異復(fù)雜，遺傳背景不明，尚未有專門的機構(gòu)對其進行深入研究，基于此，本課題以海南島益智種質(zhì)資源為材料，結(jié)合形態(tài)標記和ISSR分析，開展海南島益智種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，旨在為益智的遺傳改良和生產(chǎn)應(yīng)用以及海南島益智種質(zhì)資源的保護和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

表型變異是基因型與環(huán)境共同作用的結(jié)果，可在一定程度上反映生物遺傳變異的程度，是理解物種適應(yīng)機制的重要方法[15]。ISSR（inter-simple sequence repeats）簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性是由Zietkiewicz等[16]于1994年提出的一種以PCR（polymerase chain reactiong，聚合酶鏈式反應(yīng)）擴增為基礎(chǔ)的分析標記技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于居群遺傳學(xué)、品種鑒定、物種分類以及物種的遺傳多樣性研究中[17-19]。

1 材料與方法

1.1 材料

本課題于2014年5～6月對海南島5個地區(qū)8個居群72份益智種質(zhì)材料性狀進行觀測。各個采集地的地理位置、經(jīng)緯度、海拔高度、生境特點和樣本數(shù)見表1，由于各種原因，部分樣品被他人提前收走，未能獲得數(shù)據(jù)，導(dǎo)致各居群樣本數(shù)不一致。居群中除SY1（三亞鳳凰嶺居群）為純野生居群外，其余均為栽培居群。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀的數(shù)據(jù)處理 每叢為一份種質(zhì)材料（或稱樣品），各表型性狀皆以測量該性狀的最長（寬）處為準，株高、莖桿直徑、果穗重、果序長、座果率等性狀每叢測10個重復(fù)并取其平均值；每份樣品取30粒正常發(fā)育的單果，用游標卡尺測量果長、果寬。采集地點的地理因子用手持GPS定位儀記錄。

1.2.2 ISSR分析 從上述72份種質(zhì)材料中，取68份（分子標記材料缺HM2-3、LM1-1、QS1-3、QS2-6）材料；采用改良的CTAB法[20]提取益智嫩葉總DNA，并利用紫外分光光度計（島津UV-2700）檢測DNA的純度和濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，最后將每一份樣本DNA稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩SSR引物為哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條引物序列，由美國生命技術(shù)公司廣州合成部（life technologies）合成。從確定的反應(yīng)體系中篩選出20條多態(tài)性好及擴增條帶清晰的引物用于后續(xù)試驗。ISSR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer（Mg2+plus）3.0 μL，模板DNA（50 ng/μL） 1.0 μL，引物（100 μmol/L）1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O補足至20 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增反應(yīng)在德國Biometra公司生產(chǎn)的T1 PCR擴增儀上進行，PCR反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×loading Buffer混勻，點入15 g/L瓊脂糖凝膠（每100 mL加入5 μL GoldViewTM DNA染料）中，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓90 V，電泳約40～50 min；電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件對所獲得的表型性狀數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以變異系數(shù)CV（標準差/平均值）作為各形態(tài)性狀變異的測度；運用SPSS19.0軟件對形態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)標準差標準化后進行系統(tǒng)聚類。以擴增條帶在相對遷移位置的有無，記為“1”或“0”，用NTSYS-PC2.1對擴增條帶數(shù)據(jù)進行分析，通過類平均法（UPGMA）對68份種質(zhì)進行遺傳相似性聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀多樣性

樣品形態(tài)性狀指標的分析結(jié)果（表2）表明，72份益智材料的14個性狀均存在一定程度的變異，變異系數(shù)為0.089～0.821。14個性狀可歸類為營養(yǎng)器官、產(chǎn)量、果實形態(tài)等3個部分。營養(yǎng)器官部分包括株高、莖桿直徑2個性狀。株高的變異幅度呈中等大小，從138～385 cm不等；莖桿直徑變異幅度較株高小。產(chǎn)量部分主要包含莖桿總數(shù)、結(jié)果桿數(shù)、單株產(chǎn)量、果穗重、果序長、座果率、單果重等7個性狀。單株產(chǎn)量是所有性狀中變異程度最大的，變異系數(shù)為0.821，同時受到其余6個性狀的影響。果實形態(tài)包括果長、果寬、單果大小（果長×果寬）、單果形態(tài)（果長/果寬）及果頂端形態(tài)等5個性狀，在野外調(diào)查及觀測中，常見到果實有大、中、小及長、圓之分。按大小可粗略將益智果實分為大果、中果、小果，按形態(tài)可分為圓果、橢圓果，果頂端形態(tài)有鈍和尖2種形態(tài)。圓果型果實的果長/果寬接近于1，但絕不小于1，果粒之間排列緊密，互相擠壓；橢圓果型果實的果長/果寬大于1，果粒之間排列較為疏松，果粒之間不互相擠壓；果長/果寬越大，果實越長，排列越疏松。在所調(diào)查到的樣品中，果長/果寬范圍為1.041～1.965，比值小的極近于球形，比值大的果長較果寬長近2倍。由于果頂端形態(tài)為質(zhì)量性狀，因此未計算其變異系數(shù)，3個部分平均變異系數(shù)表現(xiàn)為CV產(chǎn)量（0.464）>CV營養(yǎng)器官（0.143）>CV果實形態(tài)（0.121），果實形態(tài)的變異較小，說明其指標有一定的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 益智表型性狀的相關(guān)性

72份益智樣品14個性狀間表現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性（表3）。91對性狀組合中有34對具有顯著相關(guān)關(guān)系。單株產(chǎn)量分別與莖桿總數(shù)、結(jié)果桿數(shù)、果穗重、座果率呈極顯著正相關(guān)，果穗重分別與果序長、單果大?。üL×果寬）呈極顯著正相關(guān)，結(jié)果桿數(shù)分別與莖桿總數(shù)、座果率呈極顯著正相關(guān)，果序長分別與單果重、單果長呈極顯著正相關(guān)，單果大小分別與單果重、果序長、果長、果寬呈極顯著正相關(guān)，單果形態(tài)（果長/果寬）分別與果頂端形態(tài)、果長呈極顯著正相關(guān)，與果寬呈極顯著負相關(guān)，果頂端形態(tài)與果寬呈極顯著負相關(guān)。

2.3 主成分分析

對14個表型性狀進行主成分分析的結(jié)果（表4）表明，前7個主成分積累貢獻率達到89.29%，基本可以包含14個性狀所含有的信息。第一主成分貢獻率為24.49%，對它影響最大的性狀包括單果大小（0.486 687）、單果重（0.451 349）、果長（0.382 861）、果寬（0.340 678），該成分與單果的體積有關(guān)，可以稱為單果體積因子；第二主成分貢獻率為21.60%，對它影響最大的性狀包括單株產(chǎn)量（0.513 016）、果穗重（0.424 571）、結(jié)果桿數(shù)（0.389 807）、莖桿總數(shù)（0.350 040）、果序長（0.295 520）、座果率（0.222 168），該成分與產(chǎn)量有關(guān)，可以稱之為產(chǎn)量因子；第三主成分貢獻率為18.76%，對它影響最大的性狀包括單果形態(tài)（果長/果寬）（0.575 507）、果頂端形態(tài)（0.453 547）、單果寬（-0.411 844）、單果長（0.368 941），該成分與形態(tài)有關(guān)，可以稱之為單果形態(tài)因子；第四、五、六、七主成分貢獻率較小，分別為7.23%、6.72%、5.65%、4.84%，對第四、六主成分影響最大的性狀都是株高，對第五主成分影響最大的性狀為莖桿直徑，株高與莖桿直徑都為營養(yǎng)器官，因此可以將第四、五、六3個主成分統(tǒng)稱為營養(yǎng)器官因子；對第七主成分影響最大的為果序長，屬于產(chǎn)量因子。

2.4 益智種質(zhì)資源表型性狀的聚類分析

用SPSS19.0軟件對72個供試材料進行聚類分析，獲得基于表型性狀的樹狀圖（圖1）。在距離值為13時，72個樣品被分為9組，其中組Ⅰ與組Ⅱ相近，組Ⅴ、組Ⅵ、組Ⅶ相近，組Ⅷ、組Ⅸ相近，各個采集地的樣品分散在各個組里。經(jīng)分析各組信息后，將單果分為大果、中果、小果，小果單果重為0.60～1.20 g；中果單果重為1.20～1.65 g，大果單果重為1.65～2.10 g；產(chǎn)量分為3個級別，果穗重與單株產(chǎn)量接近總體平均值的設(shè)為中等，遠低于總體平均值的設(shè)為產(chǎn)量較低，遠高于總體平均值的設(shè)為產(chǎn)量較高。據(jù)實際測量及觀察的結(jié)果可設(shè)定，當果長/果寬在1.0～1.2時，果近于圓形；當比值在1.2～1.4時，果略呈橢圓形；當比值在1.4～1.6時，果呈橢圓形；當比值在大于1.6，果呈長橢圓形。各組特點見表5。

2.5 ISSR分析

取68份益智種質(zhì)材料的分子材料并用20條引物對其進行PCR擴增，部分引物擴增結(jié)果見圖2，大部分擴增片段大小在200～1 500 bp。20個ISSR引物共擴增出466條譜帶，其中多態(tài)性條帶為446條，多態(tài)性比例（PPB）為95.71%（表6），表明益智種質(zhì)材料具有豐富的遺傳多樣性，ISSR標記可很好地揭示供試益智種質(zhì)材料的遺傳差異和親緣關(guān)系。采用UPGMA方法對數(shù)據(jù)進行聚類分析，得到益智種質(zhì)材料的ISSR聚類圖（圖3），由圖3可見，68份樣品相似系數(shù)在0.72～0.86，表明群體遺傳多樣性水平不高，來自各個群體的樣本基本上按照采集地點聚在一起。在相似系數(shù)0.762水平上，68份樣品被分為6組。第Ⅰ組有12份樣品，包括DZ1的10份樣品和HM1的2份樣品。第Ⅱ組有18份樣品，包含HM1的7份樣品，HM2的6份樣品，DZ1的2份樣品，LM1的2份樣品，LM2的1份樣品，本組各居群樣品比較分散。第Ⅲ組有29份樣品，包含LM1的1份樣品，LM2的8份樣品，QS1的10份樣品，QS2的10份樣品。第Ⅲ組在相似系數(shù)0.772水平上又可分為4個亞組，分別為A、B、C、D 4個亞組，A亞組包含LM1的1份樣品；B亞組有14份樣品，包含LM2的8份樣品，QS2的1份樣品，QS1的5份樣品；C亞組包含QS1的3份樣品；D亞組有11份樣品，包含QS1的2份樣品，QS2的9份樣品。各居群中以LM2及QS2的樣品較為集中，QS1的樣品較為分散。第Ⅳ組有2份樣品，包含HM2的1份樣品和LM1的1份樣品。第Ⅴ組為HM2的2份樣品。第Ⅵ類為SY1的5份樣品。從總體看，各樣品主要按來源聚在一起，其中以SY1、DZ1、LM2、QS2的樣品較為集中，LM1、QS1、HM1、HM2的樣品較為分散。SY1的樣品（野生）全部集中在一個類群中，并與其他樣品（野生撫育）最早在相似系數(shù)0.72水平上被分成2大類群，可見，SY1的野生居群與其余栽培居群具有較大的遺傳差異。

3 討論與結(jié)論

在野外調(diào)查及測量中發(fā)現(xiàn)，益智各表型性狀均存在各種變異，如株高、桿圍、葉形、果序長等均呈連續(xù)型的變異，較為明顯且易于分辨及歸納的為果實性狀，常見到果實有大、中、小及長、圓之分，果序長短差異較大，但在同一叢中各性狀表現(xiàn)均較為一致。本研究利用SPSS19.0軟件對收集到的益智形態(tài)數(shù)據(jù)進行聚類分析，72個樣品被分為9組，將表型性狀較為接近的材料很好地聚在一起。

主成分分析可以將多個相關(guān)指標綜合成較少的相互獨立或不相關(guān)的新指標，并保持絕大部分的信息量。本研究經(jīng)主成分分析綜合得到7個主成分，積累貢獻率達到89.29%，其中前3個貢獻率最大的主成分積累貢獻率達到64.85%，單果體積因子第一，產(chǎn)量因子第二，單果形態(tài)因子第三。

本研究中，利用ISSR分子標記對68份益智種質(zhì)材料進行分析，采用UPGMA方法對數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果顯示68份樣品相似系數(shù)在0.72～0.86，來自各個群體的樣本基本上按照采集地點聚在一起，可以看出，ISSR分子標記聚類具有很高的靈敏度，能夠準確地將來自不同采集地點的樣本聚在一起。

本研究中，依據(jù)ISSR標記的聚類與表型性狀的聚類結(jié)果不完全一致，在表型分析中散布在各組的SY1種群，在ISSR標記聚類中全部聚成一組，而在ISSR標記中親緣關(guān)系較近的DZ1-6和LM1-4在表型分析中則相距較遠。

本研究首次將益智種質(zhì)資源的ISSR分子標記與表型性狀的聚類進行對比分析，旨在探索分子標記聚類方法與表型性狀的聚類是否一致，并通過2種方法的結(jié)合對海南島益智種質(zhì)資源進行更為合理的鑒定與分類，然而2種聚類方法的結(jié)果并不完全一致。其原因可能在于：（1）所采用的72份益智種質(zhì)資源材料均為自然授粉的地方品種， 遺傳背景較復(fù)雜；（2）表型性狀是基因與環(huán)境間、基因與基因間互作的結(jié)果，分子標記揭示的是物種在DNA序列上的差異，因此，DNA結(jié)構(gòu)差異不一定在表型性狀上得到相應(yīng)表現(xiàn)，即使能夠表現(xiàn)，其表現(xiàn)的形式也可能因為基因間的互作或調(diào)控而呈現(xiàn)多種多樣，這也是許多作物中表型分類與分子標記分類不完全一致的主要原因[21-23]；（3）也可能是由于本研究所調(diào)查的表型性狀只是益智所有表型性狀的一部分，而ISSR標記所分析的位點則覆蓋整個益智基因組；（4）試驗研究結(jié)果也受到研究者習(xí)慣的影響，不同的研究者得出的結(jié)果可能不完全一致。同時，本研究表明，當供試材料形態(tài)相近時，表型聚類分辨能力有限，而ISSR分子標記聚類則具有更高的靈敏度，能夠準確地將來自不同采集地點的樣本聚在一起。因此，運用分子標記技術(shù)研究益智地方群體種質(zhì)的遺傳多樣性，可以不受環(huán)境、發(fā)育時期和器官等的限制，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，且在早期就可進行新品種的鑒定。

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