秦巴山區(qū)三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的分離、篩選及活性菌株的鑒定

晏　麗， 阮昌應(yīng)， 解修超， 彭　浩， 陳文強(qiáng)， 鄧百萬(wàn)

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系， 陜西 漢中 723002；3.柞水中學(xué)， 陜西 柞水 711400)

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秦巴山區(qū)三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的分離、篩選及活性菌株的鑒定

晏麗1，2， 阮昌應(yīng)3， 解修超1， 彭浩1， 陳文強(qiáng)1， 鄧百萬(wàn)1

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系， 陜西 漢中 723002；3.柞水中學(xué)， 陜西 柞水 711400)

[摘要]采用選擇性分離方法從秦巴山區(qū)三尖杉植物根際土樣中分離得到放線(xiàn)菌35株，以白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門(mén)氏桿菌(Salmonella typhl)為靶標(biāo)菌，采用濾紙片擴(kuò)散法研究三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明，16株放線(xiàn)菌表現(xiàn)出至少對(duì)一種靶標(biāo)菌有抗性，占總分離菌株的45.7%，其中，菌株CF003對(duì)所有靶標(biāo)菌均具有活性；經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因序列鑒定，這16株放線(xiàn)菌分屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)和小單孢菌屬(Micromonospora)。

[關(guān)鍵詞]三尖杉； 根際土壤；放線(xiàn)菌；抗菌活性

放線(xiàn)菌是一類(lèi)具有很高實(shí)用價(jià)值的微生物，世界各國(guó)對(duì)其研究與資源開(kāi)發(fā)極為重視。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)放線(xiàn)菌的區(qū)系調(diào)查及資源開(kāi)發(fā)雖然有一些報(bào)道，但對(duì)不同藥用植物根際土壤放線(xiàn)菌的研究很少[1-3]。土壤是放線(xiàn)菌生活的大本營(yíng)，目前已從土壤中分離出的放線(xiàn)菌主要包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單孢菌屬(Micromonospora)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、馬杜拉放線(xiàn)菌屬(Actinomadura)、繼生菌屬(Jishengella)、疣孢菌屬(Verrucosispora)以及游動(dòng)放線(xiàn)菌屬(Actinoplanes)等，但其優(yōu)勢(shì)菌群一般為鏈霉菌屬和小單胞菌屬；此外，放線(xiàn)菌還是抗生素的主要產(chǎn)生菌，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前由微生物產(chǎn)生的抗生素約有萬(wàn)余種，其中70%以上都是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的[4]。

三尖杉(Cephalotaxusfortunei)，常綠喬木或灌木，樹(shù)皮灰褐色至紅褐色，為三尖杉科三尖杉屬植物，常自然散生于海拔800 m至2 000 m的山澗潮濕地帶[5]。三尖杉屬植物含有黃酮和生物酯堿兩大化學(xué)成分，其中的生物酯堿具有較好的抗癌作用[6]，其價(jià)值得到了人們的極大關(guān)注和重視。

從藥用植物內(nèi)部分離具有抑菌活性的微生物現(xiàn)已有一些報(bào)道，例如劉兆迪等[7]分別從秦巴山區(qū)生長(zhǎng)的三尖杉根、莖、葉中分離得到30株內(nèi)生真菌，且有20株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物至少對(duì)一種靶標(biāo)菌有抑制活性。張曉偉等[8]從三尖杉根部分離得到2株內(nèi)生放線(xiàn)菌ECA023、ECA045，其中ECA023對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用。但迄今為止，尚無(wú)三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的研究報(bào)道。本研究以秦巴山區(qū)三尖杉為材料，對(duì)根際土壤放線(xiàn)菌進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)其活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，旨在發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性的菌株。這對(duì)新菌種及抑菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及三尖杉資源的開(kāi)發(fā)利用及保護(hù)都有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料

于2014年4月采集陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)天臺(tái)山三尖杉的根際土壤約50.0 g，裝入滅菌袋中，4 ℃保藏并迅速展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2靶標(biāo)菌株

白色念珠菌(Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門(mén)氏桿菌(Salmonellatyphl)，均由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基

合成(ATCC-172)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，酵母粉5 g/L，CaCO315.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，酪蛋白酶0.5 g/L，pH 7.0～7.4。

淀粉-黃豆粉發(fā)酵(SLM)培養(yǎng)基：黃豆粉15.0 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，CaCO34.0 g/L，pH 7.2～7.4。

酵母膏-麥芽浸汁(YE)液體培養(yǎng)基：酵母粉4.0 g/L，麥芽浸提取物10.0 g/L，葡萄糖4.0 g/L，pH 7.2～7.4。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨15.0 g/L，牛肉粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.3±0.1。

酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 5.0～5.5。

分離純化采用ATCC-172和SIM培養(yǎng)基，液體發(fā)酵采用YE培養(yǎng)基，待測(cè)靶標(biāo)菌培養(yǎng)基為NA(細(xì)菌)和YPD培養(yǎng)基(真菌)。

1.1.4主要儀器和設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、雙人雙面精華工作臺(tái)(SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州凈化設(shè)備有限公司)、生化培養(yǎng)箱(XPX-250BSH-Ⅱ，上海新苗衣料器械制造有限公司)、電子天平(BSA8201,MAX=8 200 g,d=0.1g，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5424R，上海艾研生物科技有限公司)、PCR儀(TC-4000，英國(guó)TECHNE公司)等。

1.2方法

1.2.1根際土壤放線(xiàn)菌的分離純化

取1.0 g風(fēng)干的土壤樣品(樣本為植物根際混合土樣，已磨碎分散均勻)，溶于10 mL無(wú)菌水中振蕩1 min，吸取1 mL溶液，加入9 mL 0.05%的SDS液中，40 ℃保溫20 min，為10-2溶液，根據(jù)需要依次稀釋至10-3、10-4，各取0.2 mL涂布于分離培養(yǎng)基，28～30 ℃培養(yǎng)5～30 d。待菌落長(zhǎng)出后，挑取形態(tài)不同的菌落，轉(zhuǎn)入ATCC-172和SIM培養(yǎng)基中，進(jìn)行純化。最后接種至試管斜面，于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.2根際放線(xiàn)菌發(fā)酵液抑菌活性篩選

將純化好的菌株接種于YE液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，28 ℃，170 r/min發(fā)酵7 d。然后用12 000 r/min的速度離心15 min，得上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后得原始濾液，用直徑6 mm的圓形無(wú)菌濾紙片蘸取濾液，放于含相應(yīng)靶標(biāo)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和沙門(mén)氏桿菌)的平板上，24 h培養(yǎng)后測(cè)定抑菌圈直徑的大小，并設(shè)置空白對(duì)照。

1.2.3抗菌活性菌株的鑒定

(1)菌株形態(tài)學(xué)特征。將分離純化的放線(xiàn)菌轉(zhuǎn)接至YE固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)7 d觀察，記錄菌絲形態(tài)、孢子絲形態(tài)、孢子排列方式、孢子形態(tài)及大小、菌落形態(tài)及顏色、孢子的顏色和能否產(chǎn)生可溶性色素等，根據(jù)以上的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征對(duì)分離純化的內(nèi)生放線(xiàn)菌進(jìn)行初步鑒定。

(2)分子生物學(xué)鑒定。將分離純化得到的放線(xiàn)菌接種到Y(jié)E液體培養(yǎng)基上，28 ℃，170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2～3 d，離心，收集菌絲體，采用核酸快速提取儀提取放線(xiàn)菌DNA。吸取1 mL含有菌絲體的發(fā)酵液，加入到1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入500 μL的TE緩沖液，在DNA快速提取儀Fastprep中震蕩1 min，速度6.0 m/s，加入500 μL氯仿：異戊醇(24∶1)，顛倒混勻10 s，室溫放置5 min，12 000 r/min離心5 min，上清液即可用作PCR模板。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)DNA。

用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1492R：5’-GGTTACCTTGTTA-CGACTT-3’為特異性引物(上海生物工程有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括模板DNA 2 μL，引物(27F/1492R)各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，無(wú)菌水21 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，60 s，55 ℃，60 s，72 ℃，90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增出的16S rRNA基因片段送至上海生工檢測(cè)序列。

2結(jié)果與分析

2.1三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的分離

采用兩種不同的培養(yǎng)基從三尖杉根際土壤中共分離得到35株放線(xiàn)菌，依次編號(hào)為CF001，CF002，…，CF035。圖1所示為三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的部分分離平板。

(a) SLM培養(yǎng)基　　　　　　　　　　　　　　(b) 1/10 ATCC172分離培養(yǎng)基圖1　三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌分離平板

2.2三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的抗菌活性篩選

采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)所分離的35株放線(xiàn)菌的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中16株菌株具有一定的抑菌活性，這16株菌株的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果顯示，共有16株放線(xiàn)菌具有不同程度的抗菌活性，占分離菌株的45.7%，其中對(duì)白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏桿菌有抑制作用的菌株分別為5、12、13、9和7株，占總株數(shù)的14.3%、34.3%、37.1%、25.7%和20.0%。這16株菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性靶標(biāo)菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)的抑制作用比革蘭氏陰性靶標(biāo)菌(大腸桿菌和沙門(mén)氏菌)的抑制作用強(qiáng)，對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌的抑制作用較靶標(biāo)真菌(白色念珠菌)的強(qiáng)。其中CF002、CF003、CF020、CF024和CF027抗菌譜最廣。CF003對(duì)所有靶標(biāo)菌均有抑制作用。CF021和CF022僅對(duì)一種靶標(biāo)菌有一定的抑制作用。

2.3三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)特征

將所分離得到的三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌株，在培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15 d后，觀察記錄各菌株菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲顏色、可溶性性色素的有無(wú)及顏色、平板菌落大小及有無(wú)暈圈等培養(yǎng)特征。部分純化的內(nèi)生放線(xiàn)菌的菌落形態(tài)見(jiàn)圖2和表2。

表1　三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌發(fā)酵液對(duì)靶標(biāo)菌株的拮抗作用

注：“++”：抑菌直徑為13～18 mm；“+”：抑菌直徑為8～12 mm；“-”：無(wú)抑菌活性。

(a) CF024在ATCC培養(yǎng)基菌落形態(tài)　　　(b) CF001在ATCC培養(yǎng)基菌落形態(tài)

(c) CF029在ATCC培養(yǎng)基菌落形態(tài)　　　(d) CF002在ATCC培養(yǎng)基菌落形態(tài)圖2　部分三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌菌落形態(tài)(15 d)

2.3.2三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的分子生物學(xué)鑒定

將菌株的16S rRNA基因序列提交到NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，選取相似度較高的菌株作為參考菌株，利用BioEdit進(jìn)行序列校準(zhǔn)，使用Mega 5.1軟件，按照近鄰結(jié)合(neighbor-joining)聚類(lèi)，選擇1 000個(gè)重復(fù)作Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

對(duì)所分離的35株放線(xiàn)菌中有抗菌活性的16株及其同源菌株基于16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖3)?？梢钥闯?，這16有活性的菌株分屬小單胞菌屬和鏈霉菌屬兩個(gè)類(lèi)群，其中菌株CF001、CF031、CF003、CF035、CF009、CF010、CF029親緣關(guān)系較近，CF027和CF004的親緣關(guān)系較近，CF017立形成一支，但以上菌株都屬于小單胞菌屬；CF002、CF013、CF020、CF022的親緣關(guān)系較近與CF024同屬一個(gè)大的分支，CF021獨(dú)立形成一支，但它們都分屬于鏈霉菌屬。

表2　部分分離純化的放線(xiàn)菌菌落形態(tài)

圖3　16株放線(xiàn)菌及其同源菌株基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3討論

美國(guó)亞利桑那大學(xué)Gimatilaka教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組對(duì)亞利桑那州索諾拉沙漠(Sonoran Desert)植物根際微生物的生態(tài)學(xué)研究表明[9]：沙漠植物根際微生物的多樣性與植物種類(lèi)及環(huán)境因素關(guān)系密切，從這些微生物中發(fā)現(xiàn)新次級(jí)代謝產(chǎn)物的幾率極大；美國(guó)愛(ài)德華大學(xué)的D L Crawford教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組發(fā)現(xiàn)北美三齒蒿(Artemisiatridentata)根際及周邊具有豐富的放線(xiàn)菌資源，很可能蘊(yùn)藏著發(fā)現(xiàn)新抗生素的微生物資源。這些研究表明，放線(xiàn)菌普遍存在于植物根際土壤中，植物與放線(xiàn)菌之間存在明顯的互利共生關(guān)系，放線(xiàn)菌從植物根部獲得營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)產(chǎn)生抗真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抗生素，防止植物真菌對(duì)植物的感染。放線(xiàn)菌的種類(lèi)和數(shù)量也因植物和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而不同，即使是同一種植物，也會(huì)因品種和生境等不同而分離出不同的放線(xiàn)菌，再加上不同實(shí)驗(yàn)室采取不同的培養(yǎng)基和分離條件，也會(huì)造成一定的差異。

袁麗杰[3]和趙坷[10]分別從多種藥用植物中分離出17屬、14屬的放線(xiàn)菌，充分顯示了藥用植物根際放線(xiàn)菌的類(lèi)群和數(shù)量多樣性。本試驗(yàn)從秦巴山區(qū)獲得三尖杉植物根際土壤，分離了35株放線(xiàn)菌，其中有10株抑菌活性較強(qiáng)，對(duì)3種及以上靶標(biāo)菌有抑制作用，占總分離菌株的28.6%，經(jīng)鑒定為鏈霉菌屬和小單胞菌屬。參考類(lèi)似生境及三尖杉內(nèi)生放線(xiàn)菌研究推測(cè)該樣本中蘊(yùn)含其他放線(xiàn)菌類(lèi)群的可能性很大，是后續(xù)研究的方向。研究秦巴山區(qū)生境中藥用植物根際土壤放線(xiàn)菌是非常必要的，對(duì)新菌種的發(fā)現(xiàn)及秦巴山區(qū)三尖杉植物的利用及保護(hù)具有非常重要的意義。

放線(xiàn)菌是一類(lèi)重要的微生物資源，是抗生素的主要來(lái)源，從微生物中分離到的生理活性物質(zhì)有70%以上為放線(xiàn)菌的代謝產(chǎn)物，而本研究對(duì)三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌的發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中有16株菌對(duì)至少一種靶標(biāo)菌有抗性占分離菌株的45.7%。其中，菌株CF003對(duì)5種靶標(biāo)菌均具有活性。說(shuō)明秦巴山區(qū)三尖杉根際土壤放線(xiàn)菌可以作為抗菌活性物質(zhì)研究的重要資源。

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[責(zé)任編輯：謝 平]

Isolation, screening and identification of active actinomycete fromCephalotaxusfortuneirhizosphere soil in Qinba Mountains

YAN Li1,2,RUAN Chang-ying3,XIE Xiu-chao1,PENG hao1,CHEN Wen-qiang1,DENG Bai-wan1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China；2.Department of Pharmaceutical and Medical Technology,Hanzhong Vocational and Technical College,Hanzhong 723002, China；3.Zhashui High School, Zhashui 711400, China)

Abstract:35 strains of actinomycetes isolated from Cephalotaxus fortunei rhizosphere soil in Qinba Mountains,China,were studied in this paper．Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences indicated that the 16 strains belong to small group of actinobacterial genera including Streptomyces and Micromonospora.Candida albicans,Escherichia coli,Bacillus subtilis,Staphylococcus aureus,Salmonella typhl were selected as indicator bacteria when the antimicrobial activities of these actinomycetes were tested through antimicrobial experiments in the exterior body.The result showed that 16 strains (45.7%) exhibited activity against at least one target strain,and the CF003 strain has strong inhibition to all target strains.

Key words:Cephalotaxus fortune；rhizosphere soil；actinomycetes；antimicrobial activity

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q939.13+2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

作者簡(jiǎn)介：晏麗(1985—)，女，陜西省漢中市人，漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院助教，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸锎x產(chǎn)活性物質(zhì)；[通信作者]解修超(1978—)，男，山東省臨沐縣人，陜西理工學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)槲⑸锎x產(chǎn)活性物質(zhì)。

基金項(xiàng)目：陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(SLGYCX1421)

收稿日期：2015-12-31修回日期：2016-02-27

[文章編號(hào)]1673-2944(2016)02-0057-07