硫酸黏菌素毒性及其殘留檢測(cè)研究進(jìn)展

代重山，李繼昌，李 健，劉 洋，王小飛，丁文建，孫 博

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030;2.Facility for Anti-infective Drug Development and Innovation，Monash Institute of Pharmaceutical Sciences Monash University，Victoria 3052，Australia)

硫酸黏菌素(colistin sulfate)，也叫硫酸多黏菌素E，屬多肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性桿菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，特別是對(duì)多重耐藥革蘭氏陰性致病菌(如銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、克雷肺炎桿菌)有特效，具有抗內(nèi)毒素作用，作為飼料添加劑還有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用，受到畜牧獸醫(yī)工作者的廣泛關(guān)注[1]。中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等許多國(guó)家批準(zhǔn)作為飼料添加劑或獸藥。我國(guó)在20世紀(jì)90年代末由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)成功研制了硫酸黏菌素原料、硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸黏菌素預(yù)混劑，并于2002年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國(guó)家三類新獸藥。肖希龍等[2]研制了硫酸黏菌素注射液，已廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)物大腸桿菌及沙門氏菌感染。目前，黏菌素已重新被各國(guó)科學(xué)家重視，其藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)、殘留檢測(cè)已被廣泛研究，本文就其毒性及檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

1 硫酸黏菌素的理化特性

硫酸黏菌素是一種至少含有30多種不同成分的混和物，主要成份為硫酸黏菌素A(也稱多黏菌素EI)和硫酸黏菌素 B(也稱多黏菌素 E2)，占77%以上[3]。其結(jié)構(gòu)由七環(huán)和末端的三肽組成的十肽菌素，尾部的脂肪酸通過酰胺鍵連接到末端的三肽，七環(huán)有親水端和疏水端，三肽端只有親水端。帶有正電荷的氨基酸和尾部的脂肪酸使黏菌素具有兼容性，可溶于水，也可溶于脂類。它為白色或微白色粉末，無臭、味苦，有吸濕性，易溶于水，在乙醇中微溶，不溶于酯、醚、酮、氯仿等有機(jī)溶劑?；瘜W(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，高壓加熱滅菌對(duì)其含量及pH影響不大[4-5]。在米糠、豆餅、淀粉等輔料中4℃存放，5年活力不變;37℃存放，活力最多只下降5%左右。硫酸黏菌素的水溶液在pH值2～6時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿中易于分解。

2 硫酸黏菌素抗菌作用及其應(yīng)用

硫酸黏菌素對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大的抗菌作用，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域可作為飼用抗生素使用，防止由大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌引起的消化道疾病，提高幼畜、雛禽的成活率，并提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)[1]。硫酸黏菌素除單獨(dú)使用外，還可與桿菌肽鋅以1∶5的比例聯(lián)用制成復(fù)合預(yù)混劑，或與活菌制劑和酶制劑配合使用[6]?？膳c磺胺類藥物、螺旋霉素、紅霉素、甲氧新霉素、土霉素配伍使用，具有較好療效，與維生素聯(lián)用做動(dòng)物止瀉藥[7]。此外，硫酸黏菌素也可用于燒傷和外傷引起的銅綠假單胞菌局部感染和眼、耳、鼻等部位敏感菌的感染或口服使用治療動(dòng)物腸道細(xì)菌感染。隨著硫酸黏菌素注射劑的開發(fā)及應(yīng)用，通過靜脈注射或肌肉注射方式治療豬及禽類腸道大腸桿菌病已廣泛使用[8]。

為規(guī)范其使用，減少藥物亂用帶來的毒副作用，WHO規(guī)定了其效價(jià)，即1 mg硫酸黏菌素相當(dāng)于20500活性單位[7]。家禽日推薦劑量為3.5 mg/kg，犢牛、豬、兔子日推薦劑量為5 mg/kg?？蓪⑵涮砑又溜嬎?、牛奶、飼料中，或注射用藥，其中，飲水添加量每升水添加25～50 mg，每100 g全價(jià)飼料添加量為2～4 g[7]。對(duì)雛雞注射推薦劑量為每天0.2 mg，一般 1 ～3 d[9]。

3 硫酸黏菌素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝及毒副作用

3.1 體內(nèi)代謝 硫酸黏菌素口服給藥及局部給藥均不易吸收。Sato等[10]給雞和豬灌注50 mg/kg兩個(gè)劑量，約2 h后在血漿和膽汁中達(dá)到最高濃度，分別為10.2、5.7 μg/mL 和 8.3、9.0 μg/mL;豬口服25 mg/kg硫酸黏菌素后，分別為1.0和4.0 μg/mL，具有明顯的種屬和劑量差異性，在肌肉和肝臟在停藥后1～8 h均未檢測(cè)到藥物的殘留，腎臟兩個(gè)劑量組在停藥2 h檢測(cè)到微量殘留但未達(dá)到可檢測(cè)的水平。但肌肉注射時(shí)，吸收良好，一般在注射后0.5～1 h達(dá)到最高血藥濃度，對(duì)豬注射5和2.5 mg/kg，青年牛肌肉注射2.5 mg/kg，鴨肌肉注射3.0 mg/kg時(shí)，均在30 min后血藥濃度達(dá)到峰值[8，11-12];對(duì)奶牛靜脈注射 5 mg/kg 硫酸黏菌素后，最高血藥濃度為16 μg/mL。血藥消除半衰期一般無劑量差異，約為2～6 h，治療后血漿中無殘留。硫酸黏菌素具有高劑量低分布的特點(diǎn)，約33% ～74%分布于細(xì)胞外液，主要經(jīng)過腎臟代謝，且血藥濃度與腎功能關(guān)系密切[9]。Zeng 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在鴨胸部注射3.0 mg/kg硫酸黏菌素后，在肌肉中消除半衰期最大，為29.44 h，其次為胸部注射部位肌肉(13.84 h)、肝臟(10.93 h)和腎臟(6.69 h)。

此外，由于動(dòng)物血腦屏障的作用，黏菌素進(jìn)入腦組織的量較少。但有研究表明，動(dòng)物發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)，給藥后可使更多的藥物進(jìn)入腦組織，這也是黏菌素發(fā)生神經(jīng)毒性的主要原因之一[13]。

3.2 毒副作用

3.2.1 急性毒性 硫酸黏菌素口服用藥時(shí)毒性相對(duì)較低，小鼠口服半數(shù)致死量(LD50)為431.39 mg/kg[2]，15 日齡雛雞的口服 LD50為 20709 mg/kg[14]。當(dāng)臨床口服劑量過大時(shí)，可引起食欲減退、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀。肌肉注射或靜脈注射給藥藥效強(qiáng)，但毒性相對(duì)較大，小鼠肌肉注射LD50分別為38.72 mg/kg[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠單次靜脈給藥半數(shù)致死量為13.52 mg/kg[15]。小鼠急性中毒癥狀基本相似，開始表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)，興奮不安，后逐漸呆滯不動(dòng)，此后腹式呼吸明顯，全身無力、癱瘓，直至死亡[11，15]。

3.2.2 腎毒性及神經(jīng)毒性 黏菌素誘發(fā)的腎毒性及神經(jīng)毒性為臨床的主要副作用，其中腎毒性發(fā)生率(約40% ～50%)遠(yuǎn)高于神經(jīng)毒性(約7%)[16]，但其毒性機(jī)制目前還不清楚。

硫酸黏菌素主要損傷腎小管上皮細(xì)胞，造成腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死及凋亡。嚴(yán)重者導(dǎo)致腎小管管型結(jié)構(gòu)，大面積梗死[17]。且連續(xù)給藥時(shí)，黏菌素將在組織中蓄積，導(dǎo)致相關(guān)組織受到一定損害。研究證明，黏菌素誘發(fā)動(dòng)物腎毒性可能機(jī)制如下，一方面是黏菌素可直接作用于腎臟，分子結(jié)構(gòu)中D型氨基酸及其在生理?xiàng)l件下所攜帶的陽(yáng)離子可與腎小管上皮細(xì)胞直接作用，即黏菌素存在的5個(gè)游離氨基可與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上帶陰性電荷的磷酸根(PO-

4)結(jié)合，造成腎小管上皮細(xì)胞的壞死及凋亡[1，9]。另一方面認(rèn)為，黏菌素脂肪酸長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)誘發(fā)其腎臟氧化應(yīng)激損傷[17-18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素C與黏菌素聯(lián)合用藥，可明顯降低腎毒性發(fā)生率[19-20]，此外，抗氧化劑褪黑素也能明顯改善腎毒性氧化應(yīng)激損傷[17]。Ozyilmaz等[18]研究證實(shí)，大鼠腹腔注射黏菌素10 mg/kg，連續(xù)給藥6 d，腎臟組織中丙二醛(MDA)含量顯著增加，超氧化物歧化酶(SOD)顯著降低，當(dāng)給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸時(shí)，腎組織中SOD及MDA有明顯的改善，此外，腎組織中誘發(fā)型一氧化氮合酶(i-NOS)及內(nèi)皮一氧化氮合成酶(e-NOS)含量均得到顯著改善。

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn):小鼠靜脈注射硫酸黏菌素7.5 mg/kg，每天2次(每次間隔12 h)，連續(xù)給藥7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)明顯的周圍神經(jīng)毒性癥狀，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速率(NCV)、動(dòng)作電位顯著降低，神經(jīng)髓鞘及軸索發(fā)生嚴(yán)重變性[21]。肖希龍[11]等研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬肌內(nèi)注射15.0 mg/kg(每天1次，連續(xù)5 d)劑量連續(xù)給藥，4～5 d后有明顯的神經(jīng)中毒癥狀。然而，神經(jīng)毒性機(jī)制目前尚不清楚，一般認(rèn)為，黏菌素脂肪酸長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)可能與脂類含量較高神經(jīng)元相互作用而引發(fā)神經(jīng)毒性，也有學(xué)者認(rèn)為，黏菌素與乙酰膽堿競(jìng)爭(zhēng)性抑制，隨后引起Ca2+離子消耗，致使去極化相延長(zhǎng)，隨后導(dǎo)致神經(jīng)癥狀的發(fā)生，并認(rèn)為這種神經(jīng)毒性的發(fā)生時(shí)可逆的[16]。

3.2.3 其他毒性 高劑量黏菌素給藥后，可伴隨發(fā)生一定的肝毒性，肖希龍[11]等研究證實(shí)，給斷奶仔豬肌內(nèi)注射注射硫酸黏菌素10 mg/kg，連續(xù)4 d后，可致肝臟發(fā)生輕微的損傷。此外，黏菌素也可對(duì)肺臟發(fā)生一定的毒性作用，Ozyilmaz等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射黏菌素10 mg/kg，連續(xù)給藥6 d，肺臟發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激性損傷。使用粘菌素也可出現(xiàn)過敏反應(yīng)，如瘙癢、皮炎和藥物熱等，可能是由藥物激活型的刺激作用和組胺釋放作用所致。

4 硫酸黏菌素的殘留檢測(cè)方法

我國(guó)和歐盟規(guī)定的硫酸黏菌素在不同組織中最高殘留限量見表1。對(duì)其進(jìn)行殘留檢測(cè)的方法主要有微生物法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。

表1 硫酸黏菌素在動(dòng)物性食品獸藥的最高殘留限量

4.1 微生物法 微生物法是多肽類抗生素殘留檢測(cè)中應(yīng)用較廣的一種檢測(cè)方法，是根據(jù)抗生素對(duì)微生物生理機(jī)能和代謝的抑制作用來對(duì)樣品中的藥物殘留進(jìn)行定性或定量分析。由于其相對(duì)費(fèi)用較低，一般實(shí)驗(yàn)室都能操作，且適合大量樣品檢測(cè)，故仍是各國(guó)對(duì)黏菌素的殘留測(cè)定主要方法，包括杯碟法、紙片法(PD)、試紙法(STOP)等。Behera 等[22]通過多黏菌素的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，比較了肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、E-test法、紙片擴(kuò)散法，發(fā)現(xiàn)E-test和瓊脂稀釋法與肉湯稀釋法顯示良好的一致性，而紙片擴(kuò)散法可適用于診斷實(shí)驗(yàn)室的初步篩選。溫芳和肖希龍[23]在國(guó)內(nèi)首次以支氣管炎博代特氏菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC4617作為檢測(cè)菌株，用PBS提取雞肌肉組織，用5%硫酸提取雞肝臟和腎臟組織中的硫酸黏菌素，應(yīng)用劑量法設(shè)計(jì)原理制備肌肉、肝臟和腎臟組織標(biāo)準(zhǔn)曲線。硫酸黏菌素檢測(cè)限肌肉組織為0.15 μg/g，肝臟和腎臟組織均為0.20 μg/g，低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部和歐盟規(guī)定的硫酸黏菌素最高殘留限量。肌肉、肝臟和腎臟組織標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.025～6.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9970、0.9994、0.9990。

4.2 免疫分析法 免疫分析法有放射性免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等多種，其中ELISA法是一種以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，較為常用。Kitagawa等[24]用黏菌素-蛋白質(zhì)共軛物免疫兔，獲得黏菌素抗體，將藥物的一個(gè)氨基結(jié)合到牛血清白蛋白(BSA)的硫醇基，用N-(m-順丁烯二酞亞胺苯甲酰)琥珀(MBS)作交聯(lián)劑共扼，多黏菌素E用β-D-半乳糖苷酶標(biāo)記，交聯(lián)劑為N-(γ-順丁烯二酞亞胺丁酰)琥珀，該法檢測(cè)限為30.0 ng/mL，可用于檢測(cè)或定量組織及食品中黏菌素。ELISA法特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速簡(jiǎn)便，可準(zhǔn)確定性、定量，已被證實(shí)，它適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣品的快速檢測(cè)，是一種較理想的獸藥殘留篩查方法[25]。但該法抗體制備比較困難，在不能肯定樣品中的獸藥品種時(shí)，有一定的盲目性，易出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性現(xiàn)象。但ELISA法采用的試劑盒一般價(jià)格較貴，且僅能對(duì)單一獸藥進(jìn)行檢測(cè)，使其應(yīng)用范圍受到了一定的限制。

4.3 HPLC法 近年來，高效液相色譜法因其選擇性好、靈敏度高、速度快和操作自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)已成為分析化學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種分析方法。目前，作為新型高效固定相的整體柱技術(shù)已走向?qū)嵱没?。整體柱是一種利用有機(jī)或無機(jī)聚合方法在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相，利用其進(jìn)行高效液相色譜分析具有低壓、高速、重現(xiàn)性好、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。丁煥中等[26]建立了硫酸黏菌素殘留柱前衍生化高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法，在豬、雞的肌肉、肝、腎組織中按 0.05、0.15、1.00 μg/g 三個(gè)添加水平做硫酸黏菌素的回收率試驗(yàn)，其回收率≥80%，變異系數(shù)≤12%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，靈敏度高，簡(jiǎn)便，可用于動(dòng)物組織中黏菌素殘留的檢測(cè)。Suhren和 Knappstein[27]通過 HPLC法檢測(cè)經(jīng)黏菌素治療的母牛的奶產(chǎn)品，最大殘留限量為50 μg/kg時(shí)，回收率為106.1%，變異系數(shù)為13.6%。檢測(cè)限和定量限分別為9.3和14.3 μg/kg。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)和熒光衍生技術(shù)是多肽類抗生素檢測(cè)的常用方法，Gmur等[28]則將老鼠和狗血漿中的多黏菌素E提取后進(jìn)行熒光衍生，再用RP-HPLC進(jìn)行分析測(cè)定，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、精密度都很好，線性范圍為0.05～5.00 μg/mL。

4.4 毛細(xì)管電泳法 毛細(xì)管電泳法是凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展和HPLC的補(bǔ)充，具有微量、快速、高效的特點(diǎn)。其中，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MECC)可同時(shí)分離分析離子型和電中性樣品分子，適用于抗生素的檢測(cè)。閆永娜等[29]采用MECC對(duì)黏菌素中的主要成分多黏菌素E1和E2進(jìn)行了分離，并測(cè)定了多黏菌素E1、E2的含量，且分別考察了電泳電壓、表面活性劑種類、Brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)濃度、乙腈含量、磷酸鹽緩沖液的pH值、氯化鈉濃度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而確定了最佳的分離條件，使得E1和E2得到了較好的分離，分離度達(dá)到1.94。以多黏菌素E1為例，柱效和峰面積的日間及日內(nèi)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%。故該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

4.5 液質(zhì)(LC-MS)聯(lián)用技術(shù) 質(zhì)譜作為高效液相色譜的高端檢測(cè)器，可以較好地給出待測(cè)物質(zhì)的定性分析結(jié)果，所以LC-MS技術(shù)既具備色譜高效分離的優(yōu)點(diǎn)，又具有質(zhì)譜可以準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可同時(shí)達(dá)到定性、定量的檢測(cè)目的，而且所需樣品量少，靈敏度高，快速準(zhǔn)確，特別適用于獸藥殘留分析研究中的確證性分析，目前，該方法為我國(guó)進(jìn)出口動(dòng)物源性動(dòng)物源性食品中硫黏菌素殘留量檢測(cè)的主要應(yīng)用方法，能方便地對(duì)納克級(jí)的獸藥殘留組分進(jìn)行檢測(cè)與結(jié)構(gòu)確證。Van den Bossche等[30]利用LC-MS法鑒別了混有多黏菌素B和多黏菌素E的牛奶樣品，可將其分離出39個(gè)峰值，并確定30多種成分的含量。Sin等[31]以多黏菌素B為內(nèi)標(biāo)物，用LC-MS/MS法分析了牛奶、動(dòng)物組織樣品中桿菌肽、黏菌素主要成分的殘留量，牛奶經(jīng)三氯乙酸去蛋白質(zhì)并離心凈化，動(dòng)物組織則借助SPE技術(shù)凈化，二者凈化后的樣品液進(jìn)一步經(jīng)RP-HPLC分離后，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下進(jìn)行質(zhì)譜掃描。桿菌肽A、黏菌素的檢測(cè)低限分別為100和50 μg/kg，所有樣品日間(n=7)和日內(nèi)(n=4)回收率范圍分別為89.12% ～110%(RSD＜10%)和90.14% ～112%(RSD＜13%)。林維宣等[32]選用牛奶為研究對(duì)象，建立了一種可同時(shí)測(cè)定多黏菌素B、黏菌素、桿菌肽和維吉尼霉素等4種多肽類抗生素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)方法，樣品經(jīng)甲醇 -0.1%甲酸體系提取，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化后，利用LC-MS/MS進(jìn)行定性和定量分析。其中黏菌素檢出限為25 μg/kg，回收率為92.24% ～97.87%，效果較好。

5 結(jié)語(yǔ)

硫酸黏菌素具有強(qiáng)大的抗革蘭氏陰性細(xì)菌作用，口服給藥時(shí)，毒性較小;其靜脈或肌肉注射已應(yīng)用于臨床，但腎毒性及神經(jīng)毒性阻礙其廣泛應(yīng)用。硫酸黏菌素殘留檢測(cè)方法，主要包括微生物法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、HPLC和LC-MS技術(shù)等。毛細(xì)管電泳法及LC-MS技術(shù)檢測(cè)精密度較高，已受到廣泛關(guān)注。先前的研究表明，硫酸黏菌素口服飼喂后，吸收較少，殘留量較低。但是，在黏菌素作為注射劑治療畜禽細(xì)菌傳染病的新時(shí)期，相關(guān)藥動(dòng)學(xué)及其殘留檢測(cè)卻研究的較少，可能會(huì)增加其毒性及耐藥性的發(fā)生率，亟待進(jìn)一步研究。

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