小麥K-CMS恢復(fù)系1BL/ 1RS和非1BL/ 1RS核型的鑒定及育性恢復(fù)基因的效應(yīng)分析

閆鵬嬌，齊 智，石曉藝，蒙立穎，段 陽，姚 盟，葉佳麗，劉子涵，宋喜悅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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小麥K-CMS恢復(fù)系1BL/ 1RS和非1BL/ 1RS核型的鑒定及育性恢復(fù)基因的效應(yīng)分析

閆鵬嬌，齊 智，石曉藝，蒙立穎，段 陽，姚 盟，葉佳麗，劉子涵，宋喜悅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要：為給K型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(K-CMS，本文簡(jiǎn)稱K型不育系)的易恢性及恢復(fù)系的恢復(fù)度研究提供參考，以三個(gè)K型不育系及69份恢復(fù)系為材料，綜合采用特異性分子標(biāo)記及醇溶蛋白的A-PAGE檢測(cè)方法對(duì)恢復(fù)系進(jìn)行1BL/1RS核型鑒定，并初步推斷恢復(fù)系恢復(fù)基因的遺傳組成及其效應(yīng)。結(jié)果表明，69份恢復(fù)系材料中，有65份屬于非1BL/1RS類型(占94.2%)，4份屬于1BL/1RS類型(占5.8%)；三個(gè)K型不育系的易恢性強(qiáng)弱依次為KTM3315A、KTP3315A、K3315A，且三個(gè)不育系間無顯著差異。各恢復(fù)系間的恢復(fù)力表現(xiàn)出較大差異，其中恢復(fù)系KR8-1-2的恢復(fù)能力較強(qiáng)且穩(wěn)定。初步推測(cè)K型不育系的育性恢復(fù)主效基因多位于1BS染色體上，恢復(fù)基因 Rfv1效應(yīng)約為60%，恢復(fù)基因 Rfv2的效應(yīng)約為10%。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞質(zhì)雄性不育；粘果山羊草；育性恢復(fù)；恢復(fù)基因

K型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(K type Cytoplasmic male sterility,K-CMS，以下簡(jiǎn)稱“K型不育系”)是以粘果山羊草(Ae.kotschyi)為細(xì)胞質(zhì)源，以斯卑爾脫小麥(T.speltaL.)、莫迦(T.machaL.)小麥和普通小麥1BL/1RS易位系莎爾蒙(T.salmonL.)為細(xì)胞核供體，通過核質(zhì)置換選育成的一類小麥雄性不育系，被認(rèn)為是一種雜交小麥研究的理想細(xì)胞質(zhì)不育類型。K型不育系具有易保持、易恢復(fù)、恢復(fù)源廣且種子飽滿，發(fā)芽率高等特點(diǎn)[1]，但是，隨著研究的深入人們逐漸發(fā)現(xiàn)K型不育系還存在諸多缺點(diǎn)，例如，多數(shù)1BL/1RS類型的K型不育系隨著小麥條銹病生理小種的變遷會(huì)逐漸喪失抗條銹性，有的還會(huì)產(chǎn)生一定頻率的單倍體，以及品質(zhì)欠佳、遇雨穗發(fā)芽等[2]。為此，何蓓如等[3]利用染色體轉(zhuǎn)移方法，將T.spelta小麥的1BS染色體片段導(dǎo)入K型不育系，選育出非1BL/1RS類型的K型不育系。前人對(duì)1BL/1RS和非1BL/1RS類型的K型不育系已有很多的研究，但對(duì)1BL/1RS和非1BL/1RS類型恢復(fù)系的遺傳效應(yīng)研究甚少。

制約小麥K型不育系生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一是難以選育出恢復(fù)度較高的恢復(fù)系。因此本研究同時(shí)也對(duì)小麥K型不育系的易恢性及恢復(fù)系的恢復(fù)度進(jìn)行比較研究，以期為優(yōu)良不育系和恢復(fù)系的選育以及不育系育性恢復(fù)遺傳機(jī)理的研究提供參考。

1材料與方法

1.1材 料

本研究所用材料包括：三個(gè)具有粘果山羊草細(xì)胞質(zhì)(Ae.kotschyi)的K型小麥雄性不育系K3315A、KTP3315A、KTM3315A，其中K3315A為1BL/1RS類型，KTP3315A和KTM3315A分別為含有斯卑爾脫(T.speltaL.)與莫迦(T.machaL.)小麥1BS染色體片段的非1BL/1RS類型；恢復(fù)系為FN3665、XY6、TB902等69份材料，以中國(guó)春和黑麥作為對(duì)照。以上材料均來自西北農(nóng)林科技大學(xué)K型雜交小麥課題組。

1.2方 法

1.2.1田間調(diào)查和恢復(fù)度統(tǒng)計(jì)

田間試驗(yàn)于2013-2014年度在西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。2013年4月，69個(gè)恢復(fù)系分別與上述三種同質(zhì)異核的K型不育系組配雜交。2013年10月，各組合F1分別單粒點(diǎn)播，行長(zhǎng)1 m，行距25 cm，株距6.7 cm，4行區(qū)，栽培管理措施按常規(guī)進(jìn)行。次年灌漿中后期每行隨機(jī)抽取5株，調(diào)查單株有效穗數(shù)、有效小穗數(shù)、穗粒數(shù)，籽粒成熟后收套袋穗?；謴?fù)度采用國(guó)內(nèi)法計(jì)算：恢復(fù)度=[有效小穗基部?jī)啥湫』ńY(jié)實(shí)數(shù)/(有效小穗數(shù)×2)]×100%數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS處理分析。

1.2.2小麥基因組總DNA的提取

基因組總DNA提取參照Cota-Sánchez[4]。提取完畢后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，并用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，最終稀釋至統(tǒng)一濃度(50～100 ng·μL-1)。

1.2.31BL/1RS易位系的特異性PCR檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[5-10]合成2對(duì)特異性引物AF1/AF4(F:5′-GGAGACATCATGAAACATTG-3′,R:5′-CTGTTGTTGGGCAGAAAG-3′)、Glu-B3 (F:5′-GGTACCAACAACAACAACCC-3′,R:5′-GTT GCTGCTGAGGTTGGTTC-3′)作為1BL/1RS的篩選標(biāo)記，其中，Glu-B3位于小麥1BS上，AF1/AF4位于黑麥1RS上，以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

PCR反應(yīng)體系(15 μL)：0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、 1.6 μL 10×Buffer(含Mg2+) 、1.2 μL dNTPs(2.5 μmol·mL-1)、2 μL引物(20 μmol·mL-1)和2 μL模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 5 min，接著32個(gè)循環(huán)。每循環(huán)為94 ℃變性40 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL 1×loading buffer,0.8%～2%瓊脂糖凝膠中加入適量核酸染料(10 μL/100 mL)，在1×TAE緩沖液中電泳檢測(cè)，膠片在GPS-8000凝膠成像儀掃描照相后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.41BL/1RS易位系醇溶蛋白的A-PAGE檢測(cè)

溶液的配制：丙烯酰胺10%，亞甲基丙烯酰胺0.4%，尿素6%，抗壞血酸0.1%，硫酸亞鐵0.005%。

(1)醇溶蛋白的提取及電泳

取單粒種子磨粉后裝入1.5 mL離心管中，加入500 μL蛋白提取液，充分混勻后室溫浸提過夜，使用前8 000 r·min-1離心15 min，取上清液點(diǎn)樣。凝膠制備：量取凝膠液20 mL倒入燒杯，立即加入15 μL 10%過硫酸銨(APS)，5 μL TEMED，迅速搖勻，倒入凝膠玻璃板之間，插好樣品梳。加樣：拔出樣品梳，加入適量的電極緩沖液，每個(gè)點(diǎn)樣孔中依次加入5～10 μL醇溶蛋白樣品，保證各孔中加樣量一致。電泳：先將電壓調(diào)節(jié)為350 V，電泳20 min，再將電壓調(diào)至500 V，電泳時(shí)間為甲基綠遷移時(shí)間的2～2.5倍，通常約2.5 h。固定和染色：固定與染色同時(shí)進(jìn)行，每板膠需100 mL 10%三氯乙酸溶液，再加入3.5 mL 1.0%考馬斯亮藍(lán)溶液，充分混勻后，放入膠片，染色1～2 d。脫色：將膠片從染色液中取出，用自來水仔細(xì)反復(fù)沖洗，直至電泳條帶清晰可見，照相，記錄結(jié)果。

(2)醇溶蛋白的A-PAGE檢測(cè)

醇溶蛋白A-PAGE檢測(cè)方法參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)1986年頒布的小麥醇溶蛋白檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法[11]，電泳結(jié)果觀察參見劉麗[12]和王瑞[13]方法。

1.2.5SSR分析

SSR引物選用Song等[14]利用KTP116A//TP116B/WM5-5回交群體定位于1BS上的 Xgwm11、Xgwm18、Xbarc137、Xgwm413，2AL上的Xwmc644、Xwmc198、 Xgwm294、Xwmc474等8對(duì)引物。PCR反應(yīng)體系及程序參照1.2.3。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL 1×loading buffer，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。統(tǒng)計(jì)標(biāo)記帶型，根據(jù)SSR標(biāo)記和雜交組合F1的恢復(fù)度綜合分析恢復(fù)系的恢復(fù)基因組成和效應(yīng)(以恢復(fù)系WM5-5組合F1的自交結(jié)實(shí)率為對(duì)照)。

2結(jié)果與分析

2.1K型不育小麥恢復(fù)系1BL/1RS核型的特異性檢測(cè)結(jié)果

以中國(guó)春和黑麥作為對(duì)照，對(duì)FN3665、XY6、TB902等69個(gè)恢復(fù)系材料進(jìn)行特異PCR檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有材料均可以擴(kuò)增出各引物對(duì)應(yīng)的特征條帶。如圖1所示，選用黑麥1RS染色體上的特異引物AF1/AF4(F:5′-GGAGACATCATGAAACATTG-3′,R:5′-CTGTTGTTGGGCAGAAAG-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，黑麥、JK29、2007A6-6-1、SY3-1、906E2均可以擴(kuò)增出1.5 kb的特異條帶，而中國(guó)春、N9209、LM1、K659-2-1、R22均未擴(kuò)增出該特異條帶；利用小麥1BS染色體上的特異引物Glu-B3 (F:5′-GGTACCAACAACAACAACCC-3′,R:5′-GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，中國(guó)春、N9209、LM1、K659-2-1、R22均能擴(kuò)增出630bp的特異條帶。因此可以推斷，若材料為1BL/1RS易位純合體，則能在位于黑麥1RS的標(biāo)記中擴(kuò)增出條帶；若為非1BL/1RS易位的小麥材料，則能在位于小麥1BS的標(biāo)記中擴(kuò)增出條帶；若為1BL/1RS易位雜合體，則能在1RS、1BS的標(biāo)記中同時(shí)擴(kuò)增出條帶。

M:DL2000; CS:中國(guó)春 Chinese Spring; Rye:黑麥；1:JK29; 2:2007A6-6-1; 3:SY3-1; 4:906E2; 5:N9209; 6:LM1; 7:K659-2-1; 8:R22；A:AF1/AF4; B:Glu-B3

圖1部分參試材料1BL/1RS的PCR分子檢測(cè)結(jié)果

Fig.1Identification of 1BL/ 1RS translocation with the PCR marker in partial tested materials

2.2K型不育小麥恢復(fù)系1BL/1RS類型的醇溶蛋白檢測(cè)結(jié)果

1:中國(guó)春 CS；2：黑麥 Rye；3:SY3-1；4:N9209；5:LM1；6:906E2；7:JK29；8:2007A6-6-1；9:K659-2-1；10:R22；11:黑麥 Rye；12:中國(guó)春 CS

圖2部分恢復(fù)系材料的醇溶蛋白A-PAGE圖譜

Fig.2Gliadin electrophoregram of part restorer lines

用A-PAGE方法對(duì)69個(gè)恢復(fù)系材料以及中國(guó)春(CS)和黑麥(Rye)醇溶蛋白進(jìn)行電泳分析后發(fā)現(xiàn)，不同恢復(fù)系材料間醇溶蛋白的組分存在較大的差異。如圖2所示，與普通小麥相比，黑麥在高分子量區(qū)(ω區(qū))含有較多的譜帶，而普通小麥的譜帶較少。張 紅等[15]研究表明，黑麥在醇溶蛋白ω區(qū)有特異帶型，而普通小麥中國(guó)春則沒有。由于黑麥ω區(qū)醇溶蛋白的多態(tài)性，因此利用此區(qū)的譜帶就可將黑麥與普通小麥區(qū)分開。如圖2所示，在ω區(qū)，黑麥的醇溶蛋白譜帶與小麥具有明顯的差異且清晰可見。因此，與黑麥ω區(qū)譜帶相同的材料為1BL/1RS類型恢復(fù)系，與中國(guó)春ω區(qū)譜帶相同的為非1BL/1RS類型恢復(fù)系。經(jīng)檢測(cè)，恢復(fù)系SY3-1、906E2、JK29、2007A6-6-1在ω區(qū)具有與黑麥相同的譜帶，而N9209、LM1等恢復(fù)系在ω區(qū)無此特征帶(表1)，說明前述4個(gè)恢復(fù)系材料屬于1BL/1RS類型(占所有恢復(fù)系總數(shù)的5.8%)，其余恢復(fù)系為非1BL/1RS類型(占所有材料的94.2%)。對(duì)兩種方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有恢復(fù)系的核型鑒定結(jié)果均一致，說明用這兩種方法鑒定的恢復(fù)系1BL/1RS與非1BL/1RS類型都是準(zhǔn)確的。

2.3K型不育小麥恢復(fù)系的恢復(fù)能力及不育系的易恢性

從表1可以看出，每個(gè)恢復(fù)系與三個(gè)不育系雜交組合的恢復(fù)度都表現(xiàn)出較大的差異。K3315A與各恢復(fù)系雜交組合F1的平均結(jié)實(shí)率為60.92%，而KTP3315A和KTM3315A與各恢復(fù)系雜交組合F1的平均結(jié)實(shí)率分別為64.18%和64.54%，比K3315A分別提高了3.26和3.62個(gè)百分點(diǎn)。三類組合平均值的標(biāo)準(zhǔn)差都相對(duì)較大(18.98%、20.64%和17.89%)，說明各組合結(jié)實(shí)率的平均值變異幅度較大，但不同不育系的平均恢復(fù)度無顯著性差異(P1=0.319>0.05，P2=0.269>0.05，P3=0.912>0.05)。KTP3315A組合F1的平均結(jié)實(shí)率和KTM3315A組合F1的平均結(jié)實(shí)率相差很小，但KTP3315A與各恢復(fù)系材料組合F1結(jié)實(shí)率變異幅度較大，標(biāo)準(zhǔn)差高達(dá)20.64%；而KTM3315A與各恢復(fù)系材料組合F1的結(jié)實(shí)率變異幅度相對(duì)較小，標(biāo)準(zhǔn)差為17.89%。不同恢復(fù)系間雜交組合F1結(jié)實(shí)率的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)差也表現(xiàn)出差異，恢復(fù)度較高的恢復(fù)系為KR8-1-2，其與K3315A、KTP3315A、KTM3315A組合F1的結(jié)實(shí)率分別為82.42%、79.80%和80.17%，三者平均值為80.80%，標(biāo)準(zhǔn)差僅為1.42%，說明該恢復(fù)系對(duì)K型不育系的恢復(fù)能力較強(qiáng)且穩(wěn)定，是K型不育系的理想恢復(fù)系材料。

2.4K型不育小麥恢復(fù)系恢復(fù)基因 Rfv1和 Rfv2的效應(yīng)

在Song等[14]研究小麥1BS、2AL染色體上與育性恢復(fù)基因連鎖的8對(duì)分子標(biāo)記中，本實(shí)驗(yàn)選用位于1BS染色體上與育性恢復(fù)基因 Rfv1連鎖的標(biāo)記 Xbarc137和位于2AL染色體上與育性恢復(fù)基因 Rfv2連鎖的標(biāo)記Xwmc644作為恢復(fù)基因效應(yīng)分析的檢測(cè)標(biāo)記(圖3)。

經(jīng)擴(kuò)增檢測(cè)，除SY3-1、906E2、JK29、2007A6-6-1之外，其余恢復(fù)系均能在位于1BS染色體上與育性恢復(fù)基因 Rfv1緊密連鎖的分子標(biāo)記 Xbarc137[14]中擴(kuò)增出多態(tài)性片段，不同恢復(fù)系擴(kuò)增的片段大小有一定的多態(tài)性(圖3)，說明這些恢復(fù)系在1BS染色體上均含有不同的育性恢復(fù)基因；而所有恢復(fù)系均能在位于2AL染色體上與育性恢復(fù)基因 Rfv2緊密連鎖分子標(biāo)記Xwmc644中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，說明各恢復(fù)系材料中均攜帶有育性恢復(fù)基因 Rfv2。由此推斷，恢復(fù)系材料SY3-1、906E2、JK29、2007A6-6-1中僅含有育性恢復(fù)基因 Rfv2。906E2與K3315A、KTP3315A、KTM3315A雜交組合F1結(jié)實(shí)率分別為7.16%、8.31%、15.75%，平均值為10.41%，說明位于2AL染色體上的育性恢復(fù)基因 Rfv2的育性恢復(fù)效應(yīng)約為10%；SY3-1與K3315A、KTP3315A、KTM3315A組合F1結(jié)實(shí)率分別為77.24%、41.53%、71.45%，平均值為63.41%，說明除1BS染色體上含有K型不育小麥主效恢復(fù)基因外，其他染色體可能還含有K型不育的恢復(fù)基因，且恢復(fù)能力很強(qiáng)。另從圖3結(jié)果可知，恢復(fù)系6-96B1和K659-2既含有恢復(fù)基因 Rfv1，又含有恢復(fù)基因 Rfv2，但其與三個(gè)不育系K3315A、KTP3315A、KTM3315A雜交F1結(jié)實(shí)率卻相對(duì)較低。6-96B1與K3315A雜交F1結(jié)實(shí)率平均值為50.51%，但與KTP3315A、KTM3315A雜交結(jié)實(shí)率平均值均小于10%，分別為6.23%、3.80%，三種組合平均結(jié)實(shí)率為20.18%；K659-2與三個(gè)不育系雜交的結(jié)實(shí)率平均值為29.67%，與KTP3315A雜交F1結(jié)實(shí)率平均值相對(duì)較高，為44.96%，其余兩個(gè)組合分別為14.54%和29.51%，說明這些恢復(fù)系可能含有影響恢復(fù)基因行使功能的基因。由表1中還可看出，大部分恢復(fù)系與三個(gè)不育系雜交組合F1結(jié)實(shí)率的平均值分布在60%～80%之間，因?yàn)閃M5-5組合F1(對(duì)照)的恢復(fù)度為77.19%，而WM5-5細(xì)胞核內(nèi)僅含有恢復(fù)基因 Rfv1和 Rfv2[14]，說明恢復(fù)基因 Rfv1的效應(yīng)約為60%。

表1　69個(gè)恢復(fù)系與3個(gè)K型不育系雜交F1的自交結(jié)實(shí)率(%)

(續(xù)表1Continued table 1)

恢復(fù)系Restorerlines1B/1R核型Karyotypeidentification1BS1RS不育系SterilelinesK3315AKTP3315AKTM3315A平均值±標(biāo)準(zhǔn)差A(yù)verage±SD2007A6-6-1-+49.6230.1767.2049.00±18.52B17+-58.3161.6964.0961.36±2.90M9813+-66.9175.6884.8975.83±8.99M9858+-49.9253.9165.6756.50±8.19F26+-50.6646.6179.0658.78±17.68SY3+-29.1179.544.4937.71±38.26SY3-1-+77.2441.5371.4563.41±19.17R161-1+-65.1782.9274.6774.25±8.885506+-72.4849.9777.8466.76±14.79R22+-48.8969.6465.4561.33±10.97YF175+-72.9270.7868.9270.87±2.00KZ20R-2+-59.8166.6560.1162.19±3.87KF7-4+-81.8575.5368.9475.44±6.46KF7-5+-64.7277.8467.3569.97±6.94KR7-8+-75.8690.2349.0871.72±20.88KR7-7+-77.4484.8580.4480.91±3.73YN19+-72.3481.5578.5677.48±4.70KR205X+-51.8446.5754.0650.82±3.855506E1+-61.3570.5465.8365.91±4.60KR538E1+-3.907.4325.8612.40±12.556-96B1+-50.516.233.8020.18±26.296-96B1Z+-66.3777.9174.7973.02±5.976-96B3+-78.5366.6580.0275.07±7.336-96B6+-52.4378.4661.6364.17±13.2906E2-+7.168.3115.7510.41±4.66R159-121+-63.4269.7071.9568.36±4.426-96Z6+-77.1375.6473.2775.35±1.956-96Z9+-70.2679.9875.8475.36±4.88平均值±標(biāo)準(zhǔn)差A(yù)verage±SD60.92±18.98a64.18±20.64a64.54±17.89a

“+”代表有該染色體的特異帶，“-”代表無該染色體的特異帶；a表示0.05顯著水平

“+” represents has the specific band of the chromosome，“-” represents has no the specific band of the chromosome; “a” indicates 0.05 significance level

1:Maker 2;2:WM5-5;3:FN3665;4:XY6;5:N9209;6:6-96B1;7:K659-2;8LM1;9:K659-2-1;10:R22；11:K460;12:8330;13:85S504；14:N9806;15:KR8-1-2; 16:J50-1;17:90(13)21;18:SS2;19:KR7-7;20:388-5;21:AR783;22:9023;23:LM1W;24:R259;25:JN13;26:KF7-5;27:L1;28:223-3;29:B17;30:R161-1；31:F26;32:M9813;33:6-96B1；34:6-96Z6;35:R159-121

圖3SSR標(biāo)記Xbarc137和Xwmc644對(duì)部分恢復(fù)系的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3SSR analysis on some restorers with primer Xbarc137 and Xwmc644

3討 論

3.1K型不育小麥恢復(fù)系非1BL/1RS核型的檢測(cè)

1BL/1RS易位系的檢測(cè)有許多方法，主要包括細(xì)胞學(xué)鑒定、分子標(biāo)記[16]、籽粒貯藏蛋白的A-PAGE[17]和SDS-PAGE[18]、單克隆抗體[19]、GISH、FISH、高效液相色譜[20]等。本研究采用來源于黑麥1RS的特異性STS-PCR、SCAR、SSR標(biāo)記以及小麥1BS上的特異性標(biāo)記對(duì)69份恢復(fù)系材料進(jìn)行鑒定，輔以中國(guó)春和黑麥作為正反對(duì)照，兩類標(biāo)記相互驗(yàn)證，結(jié)果表明，恢復(fù)系中有4份1BL/1RS易位系，65份非1BL/1RS易位系。在所有選用標(biāo)記中，來源于黑麥1RS的SCAR標(biāo)記AF1/AF4與來源于小麥1BS的特異性標(biāo)記Glu-B3瓊脂糖檢測(cè)譜帶單一且清晰明顯，因此認(rèn)為這兩個(gè)標(biāo)記可作為K型不育小麥恢復(fù)系1BL/1RS核型檢測(cè)的可靠有效標(biāo)記。利用醇溶蛋白檢測(cè)方法能有效鑒定出小麥1BL/1RS易位系，也可作為K型不育小麥恢復(fù)系分子鑒定的重要輔助手段。

3.2K型小麥不育系的易恢性及恢復(fù)系的恢復(fù)度差異

大量研究證實(shí)，雜交小麥的育性恢復(fù)受兩方面遺傳因素的影響，其一是不育系的易恢性差異，其二是恢復(fù)系的恢復(fù)能力差異[21]。楊天章等[22]研究認(rèn)為，K型不育系育性恢復(fù)除與主效恢復(fù)基因相關(guān)外，還受到不育系微效基因、修飾基因、核質(zhì)互作、育性基因間互作、遺傳背景、外界環(huán)境等多因素的影響。張改生等[23]研究認(rèn)為，不育系的核內(nèi)含有兩種不育基因類型，一是單對(duì)主效不育基因(或者是1RS的片段)，二是單對(duì)主效不育基因+部分抑制基因，育性抑制基因會(huì)降低雜交組合F1的育性。不育系的易恢性和同一不育系與不同恢復(fù)系雜交組合F1育性會(huì)表現(xiàn)出很大的變異幅度，本試驗(yàn)的結(jié)果中也體現(xiàn)出這一點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，非1BL/1RS類型不育系KTP3315A和KTM3315A的易恢性優(yōu)于1BL/1RS類型不育系K3315A，說明由于斯卑爾脫(T.speltaL)與莫迦(T.machaL)1BS染色體的導(dǎo)入，有可能使K型不育系的易恢性得到提升。

3.3K型小麥不育系育性恢復(fù)基因的組成及其效應(yīng)

眾多研究表明，小麥K型不育系的育性恢復(fù)是由位于1BS染色體上 Rfv1單基因控制，而且還與部分修飾基因以及不育系的遺傳背景有關(guān)[24-25]。劉曙東等[26]選用F1代及回交分離群體進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，K型不育系育性恢復(fù)由兩對(duì)基因控制，分別為恢復(fù)作用較強(qiáng)的基因 Rfk1和恢復(fù)作用較弱的 Rfk2，且兩對(duì)基因的作用具有累加效應(yīng)，當(dāng)基因型為 Rfk1Rfk2時(shí)完全可育。孫兆全等[27]認(rèn)為，K型不育系的恢復(fù)系恢復(fù)度高的攜帶有兩對(duì)育性恢復(fù)基因，恢復(fù)度低的攜帶有一對(duì)恢復(fù)基因。劉保申等[25]研究認(rèn)為，K型不育系具有一對(duì)主效育性恢復(fù)基因以及眾多微效恢復(fù)基因。本研究結(jié)果表明，非1BL/1RS類型的恢復(fù)系攜帶有育性恢復(fù)基因 Rfv1，而1BL/1RS類型的恢復(fù)系中不含育性恢復(fù)基因 Rfv1；本研究的恢復(fù)系中均含有恢復(fù)基因 Rfv2，且 Rfv1恢復(fù)效應(yīng)大于 Rfv2。不同1BL/1RS類型恢復(fù)系的恢復(fù)力存在明顯的差異，而不同非1BL/1RS恢復(fù)系的恢復(fù)力也存在較大的差異。初步推斷不同的恢復(fù)系材料含有的育性恢復(fù)基因數(shù)目及恢復(fù)基因的效應(yīng)存在一定程度差異，這還需要進(jìn)一步的深入研究。

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Identification of 1BL/1RS and Non 1BL/1RS Type of the Restorer Lines and the Effect of Restoring Gene in K-type Cytoplasmic Male Sterility Lines of Wheat

YAN Pengjiao,QI Zhi,SHI Xiaoyi,MENG Liying,DUAN Yang,YAO Meng,YE Jiali,LIU Zihan,SONG Xiyue

(College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100，China)

Abstract:With 3 sterile lines and 69 restorer lines as test materials, the easy restoration of fertility among sterile lines and restoring degrees of different restorers for K male sterile lines were studied. The specific markers and the A-PAGE method for detecting the gliadins were used to distinguish 1BL/1RS type and non 1BL/1RS type of wheat. The composition of K-type restorer genes and its effects were indicated. Among 69 restorer lines, 65 species are non 1BL/1RS type, accounting for 94.2%; four restorer lines are 1BL/1RS type, accounting for 5.8%. The easy restoration of fertility in 3 sterile lines is ranked as KTM3315A, KTP3315A, and K3315A，and there is no significant difference on fertility restoration of the three lines. The restoring degree of different restorers also showed great differences. The restorer line KR8-1-2 has strong and stable recovery ability. It is preliminary inferred that the major fertility restoring genes are located on 1BS chromosome in wheat K male sterile line. The effect of restoration gene Rfv1 is approximately 60%, while the effect of restoration gene Rfv2 is about 10%.

Key words:CMS (Cytoplasmic male sterility); Aegilops kotschyi; Fertility restoration; Restorer gene

中圖分類號(hào)：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)02-0136-09

通訊作者：宋喜悅(E-mail：songxiyue@126.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271792); 陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2014K02-04-01); 西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

收稿日期：2015-07-09修回日期：2015-09-08

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-26

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.004.html

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