NC膜富集法、實時熒光PCR法、培養(yǎng)法檢測志賀菌的比較研究

韋婕,郭欣欣,梁君瑜,吳英松，劉天才

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

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NC膜富集法、實時熒光PCR法、培養(yǎng)法檢測志賀菌的比較研究

韋婕1,2,郭欣欣1,梁君瑜1,吳英松1，劉天才1

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

摘要：觀察、比較硝酸纖維素膜富集法、實時熒光PCR法及傳統(tǒng)培養(yǎng)法對志賀菌陽性檢出率的不同.對137例臨床樣本分別采用硝酸纖維素膜富集法、實時熒光PCR法、傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測.3種方法檢測結(jié)果陽性率分別為13.14%、20.44%、8.03%.硝酸纖維素膜富集法是在培養(yǎng)法基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn)，采用“先分離再培養(yǎng)”的方法，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，檢測結(jié)果陽性率明顯提高，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).另一方面，硝酸纖維素膜富集法耗時較短，特異性高，成本低并且無需特殊設(shè)備，特別適宜基層檢測單位和健康篩查單位使用.實時熒光PCR法檢測結(jié)果陽性率最高，但同時假陽性率也最高.傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果陽性率最低，但現(xiàn)今在臨床工作中仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為志賀菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法.研究結(jié)果顯示，硝酸纖維素膜富集法檢測志賀菌，明顯提高了檢測結(jié)果的陽性率，且特異性高、耗時較短，具有很好的臨床應(yīng)用前景.

關(guān)鍵詞：硝酸纖維素膜富集法；志賀菌；培養(yǎng)法

0引言

志賀菌是人類主要的腸道病原菌之一，可引起人類細(xì)菌性痢疾[1].其傳染源有細(xì)菌性痢疾病人、恢復(fù)期帶菌者、慢性帶菌者和健康帶菌者.該病菌主要通過糞-口途徑傳播，引起的細(xì)菌性痢疾多數(shù)為散發(fā)病例，偶爾因其污染的水和食物而引起爆發(fā)流行，任何季節(jié)均可發(fā)病.痢疾志賀菌引起的菌痢特別嚴(yán)重，死亡率較高.其他種屬志賀菌引起的感染相對較輕，預(yù)后較為良好，但是急性感染者若治療不及時或者治療不徹底，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槁訹1].一些非典型菌痢由于癥狀不典型，極易造成誤診和漏診.因此，及時、準(zhǔn)確檢測病原菌為臨床診治提供明確檢驗結(jié)果就顯得非常重要且必要.

目前檢測志賀菌的方法眾多[2-3]，如分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等都應(yīng)用于志賀菌的檢測，這些方法雖然有一定的優(yōu)勢，如檢測靈敏度高、檢測快速等等，但不管何種方法檢測出來的陽性結(jié)果，最終均需要通過分離培養(yǎng)與鑒定，也就是國標(biāo)法進(jìn)行確證.而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法耗時長且檢測陽性率低.因此為了提高傳統(tǒng)培養(yǎng)法的陽性檢測率，我們在傳統(tǒng)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，建立了硝酸纖維素膜富集法(以下簡稱NC膜富集法)檢測志賀菌.NC膜富集法的基本原理是利用抗原抗體特異結(jié)合的特性，用包被好志賀菌特異抗體的硝酸纖維素膜富集樣本中的志賀菌，將志賀菌從復(fù)雜的糞便環(huán)境中純化出來，然后再進(jìn)行后續(xù)的增菌培養(yǎng)鑒定.本文中用新建立的NC膜富集法與實時熒光PCR法、傳統(tǒng)培養(yǎng)法對臨床樣本進(jìn)行檢測，實驗數(shù)據(jù)表明，新建立的NC膜富集法對志賀菌的陽性檢出率明顯提高，從而大大減少了其漏檢率，在臨床檢驗領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本本實驗采用的是主訴為“腹瀉”的臨床標(biāo)本137例，標(biāo)本采集后，均在2 h內(nèi)進(jìn)行檢測.

1.1.2試劑沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(以下簡稱SS培養(yǎng)基)，購自安圖生物；營養(yǎng)肉湯，購自杭州天和微生物試劑有限公司；硝酸纖維素膜，購自Millipore公司；志賀氏菌多價診斷血清，購自寧波天潤(注冊號：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第3400957號)；沙門志賀氏菌PCR檢測試劑盒，購自深圳市生科源技術(shù)有限公司.所有試劑均在有效期內(nèi)使用.

1.1.3主要儀器恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅公司，BSP-250；實時熒光PCR儀，MX3005P(Stratagene).

1.2實驗方法樣本處理：取1 g新鮮采集糞便標(biāo)本放入9 mL營養(yǎng)肉湯中，用振蕩器混勻.取1 mL進(jìn)行實驗.每份樣本分成3組，每組重復(fù)3管.分別用NC膜富集法、實時熒光PCR法、傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測.

1.2.1NC膜富集法檢測

1) 拭子條制備：將剪裁好的硝酸纖維素膜置于1 mL志賀氏菌多價診斷血清試管中包被30 min，取出后置于10%胎牛血清中4 ℃過夜封閉，再將包被好后的硝酸纖維素膜固定于拭子條上.

2) 硝酸纖維素膜富集標(biāo)本中的志賀菌：將包被了志賀菌抗體的硝酸纖維素膜拭子條一端浸入待測標(biāo)本管中，放置于37 ℃水浴箱富集30 min.

3) 取出拭子條,用營養(yǎng)肉湯沖洗3次，置于新的營養(yǎng)肉湯管中增菌3 h.

4) 取出拭子條后再次用營養(yǎng)肉湯沖洗3次，富集完成后的硝酸纖維素膜拭子條直接涂布于SS選擇培養(yǎng)基上.

1.2.2實時熒光PCR法檢測

1) PCR反應(yīng) 采用25 μL反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液19.5 μL，混合酶液0.5 μL，樣本模板5 μL；PCR循環(huán)參數(shù)：UNG處理，50 ℃ 2 min；預(yù)變性95 ℃ 3 min；后續(xù)循環(huán)95 ℃ 5 s，55 ℃ 60 s，40個循環(huán).

2) PCR法檢測志賀菌取1 mL處理好的樣本，取樣本經(jīng)自然沉降后的上清液，用12 000 r/min 離心5 min后棄去上清保留沉淀，加入DNA提取液50 μL，懸浮后100 ℃加熱處理5 min，再次12 000 r/min 離心2 min，取上清液做為樣本模板.按照1)方法進(jìn)行PCR反應(yīng).

1.2.4結(jié)果綜合判斷3管重復(fù)樣本大于等于兩管陽性則結(jié)果判為陽性，大于等于兩管陰性則判為陰性.

1.2.5統(tǒng)計方法兩種方法陽性率比較采用配對x2檢驗.

2結(jié)果與分析

2.1137例臨床標(biāo)本NC膜富集法檢測陽性18例，陽性檢出率為13.14%；實時熒光PCR法檢測陽性28例，陽性檢出率為20.44%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測陽性11例，陽性檢出率為8.03%.

表1　NC膜富集法、實時熒光PCR法、

3種方法檢測結(jié)果實時熒光PCR法陽性率最高，傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性率最低.3種方法陽性檢出率結(jié)果見表1.

2.2137例臨床標(biāo)本NC膜富集法與實時熒光PCR法兩法檢測均陽性18例；NC膜富集法檢測陽性、實時熒光PCR法檢測陰性0例；NC膜富集法檢測陰性、實時熒光PCR法檢測陽性10例；兩者均陰性109例.NC膜富集法陽性率13.14%，PCR法陽性率20.44%，經(jīng)x2檢驗,兩方法陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002 < 0.05)，結(jié)果見表2.

表2NC膜富集法、實時熒光PCR法檢測結(jié)果比較

(n=137)

PCR法NC膜富集法+-合計+181028-0109109合計18119137

表3NC膜富集法、傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較

(n=137)

國標(biāo)法NC膜富集法+-合計+11011-7119126合計18119137

2.3137例臨床標(biāo)本NC膜富集法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法兩法檢測均陽性11例，NC膜富集法檢測陽性而傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測陰性7例，NC膜富集法檢測陰性、傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測陽性0例，兩者均陰性119例.NC膜富集法檢測陽性率13.14%，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測陽性率8.03%，經(jīng)配對x2檢驗,兩方法陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016 < 0.05)，結(jié)果見表3.

3討論

本研究同時用NC膜富集法、實時熒光PCR法、傳統(tǒng)培養(yǎng)法對相同樣本進(jìn)行檢測，3種方法的陽性檢出率分別為13.14%、20.44%、8.03%，高于文獻(xiàn)報道的志賀菌陽性檢出率[4-7]，這與標(biāo)本選擇有關(guān)，因為我們采用的標(biāo)本是主訴為“腹瀉”的標(biāo)本，符合志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾癥狀，因此，相對于大多數(shù)文獻(xiàn)報道的大量體檢標(biāo)本或者入院常規(guī)檢查標(biāo)本陽性檢出率明顯偏高.

我們建立的NC膜富集法是在傳統(tǒng)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將要檢測的志賀菌通過包被了特異抗體的硝酸纖維素膜拭子條先富集，將標(biāo)本中的志賀菌盡可能地從復(fù)雜的糞便環(huán)境中純化出來，然后再進(jìn)行增菌和分離檢測.通過富集作用后，在去除了樣本中大量雜菌的情況下，減少了雜菌的“營養(yǎng)竟?fàn)帯币种谱饔?，使志賀菌在檢測環(huán)境中由原來的相對劣勢菌成為優(yōu)勢菌，也就是提高了志賀菌的檢測濃度，從而大大提高檢測陽性率.

研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，NC膜富集法與實時熒光PCR法比較，兩者檢測志賀菌的陽性率經(jīng)配對x2檢驗顯示,兩方法陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016<0.05)， NC膜富集法檢測陽性率低于實時熒光PCR法；雖然如此， NC膜富集法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，兩者的檢測陽性率經(jīng)配對x2檢驗結(jié)果顯示兩方法檢測陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002<0.05)，結(jié)果證明NC膜法較之于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，志賀菌的檢出率顯著提高.同時這個結(jié)果也說明，實時熒光PCR法雖然檢測靈敏度很高，但存在一定的假陽性.而傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測為陽性的11例標(biāo)本，用NC膜富集法進(jìn)行檢測，結(jié)果也全部顯示為陽性，證明NC膜富集法檢測志賀菌的特異性很高，未發(fā)現(xiàn)有假陽性結(jié)果.另一方面，NC膜富集法檢測志賀菌，增菌時間僅需3 h就可以達(dá)到良好的檢測效果，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，檢測時間明顯縮短，大大提高了檢測效率，這在臨床檢測工作中節(jié)約了更多的時間成本，可以更快為臨床提供準(zhǔn)確的檢驗報告.

實時熒光PCR法是對食品相關(guān)從業(yè)人員以及幼教從業(yè)人員常用的篩查方法[8-9]，由于其操作相對簡單、快速，并且可以批量進(jìn)行檢測[8,10-11]，因此也是體檢樣本以及食品、水源污染的首選常用檢測方法.實時熒光PCR法靈敏度高，可以最大程度避免漏檢.但同時，它的假陽性率也較高，這個缺點也制約了實時熒光PCR法的臨床應(yīng)用.在臨床工作中，實時熒光PCR法檢測結(jié)果為陽性的樣本需經(jīng)過傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行確證.而傳統(tǒng)培養(yǎng)法受標(biāo)本中雜菌或者其他干擾物質(zhì)的“營養(yǎng)竟?fàn)帯庇绊慬8]，導(dǎo)致其陽性檢出率低，特別是對于樣本中志賀菌濃度低的樣本.而多數(shù)從事餐飲、食品加工及幼師等的從業(yè)者，即便是通過PCR法篩查為陽性，往往也是健康的帶菌者，其糞便中志賀菌濃度很低，在用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測時結(jié)果多數(shù)為陰性，導(dǎo)致兩種方法檢測相符率非常低.而NC膜富集法在培養(yǎng)法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，可以明顯提高檢測結(jié)果的陽性率，因此，若實時熒光PCR法檢測篩查為陽性的標(biāo)本，再使用本研究建立的NC膜富集法進(jìn)行確證，可顯著提高檢測結(jié)果的相符率，大大減少了漏檢率，為臨床提供更為快速、準(zhǔn)確的檢驗報告.

NC膜富集法由于暫無標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，志賀菌多價血清包被的硝酸纖維素膜需自行制備，暫時難以做到標(biāo)準(zhǔn)化.盡管如此，從本研究的結(jié)果數(shù)據(jù)看來，NC膜富集法較之于傳統(tǒng)培養(yǎng)法已經(jīng)顯示了明顯的優(yōu)越性，并且其操作簡單、成本低廉、無需特殊設(shè)備，在顯著提高陽性檢出率的基礎(chǔ)上明顯縮短檢測時間，值得進(jìn)一步規(guī)范化推廣，并應(yīng)用于臨床糞便樣本志賀菌的檢測.

4參考文獻(xiàn)

[1] 張卓然，倪語星.臨床微生物學(xué)和微生物檢驗[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004:118-119.

[2] 李勁鋒.志賀菌檢驗技術(shù)的研究進(jìn)展[J].職業(yè)與健康,2014,30(13):1874-1877.

[3] 羅宇鵬.不同方法檢測食源性致病菌的對比研究[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2015(7):918-919,922.

[4] 江倔,李真,吳改玲,等.門診細(xì)菌性痢疾志賀菌檢測結(jié)果分析[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2010,13(1):47-49.

[5] 田忠梅,趙偉.致腹瀉病原菌的檢測分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(5)：664.

[6] 吳海娟.實時熒光PCR快速同時檢測從業(yè)人員沙門菌和志賀菌結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(12):2323-2325.

[7] 陳銘,于艷華,張立麗,等.腸道門診165例腹瀉患者的病原菌及流行病學(xué)分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21(11):2247-2248.

[8] 褚國方,張月娟,李明珠,等.Real-time PCR技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測腸道沙門菌和志賀菌的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(8):1458-1460.

[9] 賀電,張曉曦,單志蘭,等.PCR檢測技術(shù)在志賀菌引起的腹瀉疫情中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(5):858-860.

[10] 楊小蓉,趙晉,張元群,等.PCR檢測糞便中志賀菌[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2008,24(11):913-915.

[11] 陳紅遠(yuǎn),鐘青萍,王麗,等.PCR技術(shù)快速檢測痢疾志賀菌的研究[J].衛(wèi)生研究,2010,39(5):597-600.

(責(zé)任編輯游俊)

Comparative study on the detection of Shigella with NC membrane enrichment method,real-time PCR method and culture method

WEI Jie1,2,GUO Xinxin1,LIANG Junyu1,WU Yingsong1,LIU Tiancai1

(1.School of Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,China)

Abstract:Nitrocellulose membrane enrichment method,real-time PCR method and the culture method were employed to detect Shigella of 137 clinical samples.Observed the positive detection rate of the three methods.The positive detection rate of the three methods were as follows:13.14%,20.44%,8.03%.Based on the culture method,the nitrocellulose membrane enrichment method made some improvements and adopted the method of “separation first,then culture”.Compared with the culture method,the positive rate was increased obviously,the two groups had statistical significance (P<0.05).On the other hand,the nitrocellulose membrane enrichment method had short testing time,highly specific and highly positive rate and a lower cost.In addition,this method does not need specific installation and technology,so it has certain clinical application value,particularly suit for the primary medical units and the health examination management centers.The highest positive rate was the real-time PCR method,but aslo the false positive result was the highest.The lowest positive rate was the culture method,but nowadays the culture method is still as the gold standard to detect Shigella.The results showed that,the nitrocellulose membrane enrichment method had the advantages of high specificity and short testing time,this method had bright clinical applied prospect.

Key words:nitrocellulose membrane enrichment method; Shigella; culture method

中圖分類號:Q93-332;R446.13

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2016.03.018

文章編號:1000-2375(2016)03-0271-04

作者簡介：韋婕(1984-)，女，主管技師；劉天才，通信作者，博士，研究員，E-mail:liutc@smu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21575058)資助

收稿日期:2015-08-27