UASB反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)

張立國,班巧英*,李建政(.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006；.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 50090)

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UASB反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)

張立國1,班巧英1*,李建政2(1.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150090)

摘要：采用間歇培養(yǎng)方式探討了升流式厭氧污泥床(UASB)反應(yīng)器中不同營養(yǎng)類型產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)規(guī)律.研究結(jié)果表明,產(chǎn)甲烷螺旋菌(Methanospirillum)是該反應(yīng)器的主要?dú)錉I養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,而主要乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為產(chǎn)甲烷絲狀菌(Methanosaeta).在35℃條件下,氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的累計(jì)甲烷產(chǎn)量分別為24.7, 11.7mL,而最大產(chǎn)甲烷速率分別為0.74, 0.18mL/h.當(dāng)溫度從35℃分別降低至30, 25, 20, 15℃時(shí),導(dǎo)致氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的累計(jì)產(chǎn)甲烷量分別減少了14.2%, 34.0%, 47.0%, 57.5%,而乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的累計(jì)產(chǎn)甲烷量分別減少了5.1%, 23.9%, 45.3%, 95.7%.由此可見,在20～30℃時(shí)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫更加敏感,而在15℃以下時(shí)乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫更加敏感.

關(guān)鍵詞：UASB反應(yīng)器；產(chǎn)甲烷菌；溫度脅迫；產(chǎn)甲烷量

* 責(zé)任作者, 講師, banqiaoying@163.com

有機(jī)物厭氧生物處理是在一系列微生物的協(xié)同代謝作用下完成的,包括水解發(fā)酵菌群,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌,同型產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌[1-3].其中,產(chǎn)甲烷菌位于食物鏈的最末端,在產(chǎn)甲烷系統(tǒng)中占有獨(dú)特的生態(tài)位[4].由于產(chǎn)甲烷菌只能利用H2/CO2,乙酸,甲酸,甲胺等簡(jiǎn)單的底物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,且增殖緩慢,對(duì)環(huán)境因子變化亦較敏感,因此通常被認(rèn)為是厭氧生物處理過程的限速步驟[5-6].溫度是厭氧微生物重要生態(tài)因子之一,它不僅能夠影響微生物的生長(zhǎng)速率,同時(shí)可能會(huì)改變微生物的活性、豐富度等[7-8].另外,溫度變化可能會(huì)引起系統(tǒng)pH值下降和游離氨濃度的增加,進(jìn)而影響水解,產(chǎn)酸發(fā)酵和產(chǎn)甲烷效率,最終影響到厭氧生物處理反應(yīng)器效能及其穩(wěn)定性[9-10].

目前,關(guān)于溫度變化對(duì)厭氧反應(yīng)器中不同營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌活性影響的報(bào)道較少,本研究考察了產(chǎn)甲烷菌群對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)規(guī)律,為厭氧生物處理反應(yīng)器運(yùn)行調(diào)控提供參考.

1　材料與方法

1.1 接種污泥

接種污泥取自本實(shí)驗(yàn)室正在運(yùn)行的升流式厭氧污泥床反應(yīng)器(UASB),該反應(yīng)器長(zhǎng)期處理丙酸合成廢水(以丙酸為唯一碳源).UASB的運(yùn)行情況,溫度35℃,水力停留時(shí)間(HRT)10h,進(jìn)水COD 3000mg/L,比COD去除率和比甲烷生成率分別為1.4kgCOD/(kgVSS·d)和285.3LCH4/ (kgCODremoved· d).

1.2 靜態(tài)搖瓶試驗(yàn)

靜態(tài)搖瓶試驗(yàn)采用間歇培養(yǎng)方式進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)容器為150mL血清瓶.每個(gè)血清瓶中加入10mLUASB反應(yīng)器中的厭氧顆粒污泥(MLVSS為2.4g/L)和40mL液體培養(yǎng)基,其中碳源分別為H2/CO2(150mL,體積比4:1)或乙酸(500mg/L).將培養(yǎng)液pH值用1mol/L HCl 或1mol/L NaOH調(diào)至7.0.然后將血清瓶分別置于5個(gè)恒溫空氣浴搖床(15,20,25,30,35℃)進(jìn)行靜態(tài)搖甁試驗(yàn).每個(gè)溫度梯度做3個(gè)平行樣,數(shù)據(jù)分析取其平均值.每12h測(cè)定一次產(chǎn)氣量,氣體組成,每24h測(cè)定一次揮發(fā)酸組成.

1.3 DNA提取和qPCR分析

取0.15g污泥樣品用磷酸緩沖液沖洗若干次進(jìn)行DNA提取.基因組DNA提取采用DNA提取試劑盒(MO Bio Laboratories,Inc.,Carlsbad,CA, USA).以前的研究發(fā)現(xiàn),該UASB反應(yīng)器中的產(chǎn)甲烷菌主要來自產(chǎn)甲烷絲狀菌屬(Methanosaeta)和產(chǎn)甲烷螺旋菌屬(Methanospirillum)[11].因此,對(duì)這兩個(gè)屬的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行定量分析.所用引物分別為,Methanosaeta,5′-GCATCGAGATTTAAAG CTC-3′,5′-AGCCAGATTTGTAACCTGGC-3′;M ethanospirillum,5′-AACGGCCCAACAAGCCT GTC-3′,5′-GGACTTGTATATCCAGCA CG-3′.

本實(shí)驗(yàn)中的定量分析采用絕對(duì)定量方式.標(biāo)準(zhǔn)樣品為含目的基因序列的重組pMD18-T質(zhì)粒.將標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋(101～107).標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(qPCR).qPCR在熒光定量分析系統(tǒng)(Model 7500,ABI,Foster,CA,USA)中完成,所用熒光染料為SYBR green.反應(yīng)體系:引物1μmol/L,SYBR Green Mix 10μL(Toyobo Co.,LTD.,Japan),H2O 5.96μL,ROX 0.04μL,DNA模板3μL.反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性1min,94℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 35s數(shù)據(jù)采集,40個(gè)循環(huán).每個(gè)qPCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù).以達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒數(shù)目的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到關(guān)于Methanospirillum和Methanosaeta的一元線性回歸方程分別為y=-0.3051x+11.626 (R2= 0.9929),y=-0.2669x+10.455 (R2=0.9982).

1.4 分析項(xiàng)目及方法

生物量(揮發(fā)性懸浮固體總量MLVSS)采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[12],甲烷發(fā)酵產(chǎn)氣量通過10～50mL的玻璃注射器排氣計(jì)量.發(fā)酵氣體的組分和揮發(fā)酸濃度分別采用山東魯南瑞虹化工儀器有限公司的SP-6800A型(TCD檢測(cè)器)和SP-6890型(FID檢測(cè)器)氣相色譜測(cè)定.累計(jì)甲烷產(chǎn)量參照Owen法進(jìn)行計(jì)算[13].

1.5 動(dòng)力學(xué)分析

不同溫度下的產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)分析參照Gompertz模型.公式如式(1):

其中:M為反應(yīng)t(h)累計(jì)甲烷產(chǎn)量,mL;Pmax為最大產(chǎn)甲烷量,mL;Rmax為最大產(chǎn)甲烷速率,mL/h;,λ為延遲時(shí)間,h.將累計(jì)甲烷產(chǎn)量和相應(yīng)反應(yīng)時(shí)間代入公式,用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 8.0計(jì)算出Pmax、Rmax、λ[14].

2　結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)甲烷菌的定量分析

在進(jìn)水COD 3000mg/L和35℃條件下, UASB 的COD去除率為95%,比產(chǎn)甲烷速率為0.26L/g CODremoved,說明一些較高活性的產(chǎn)甲烷菌存在于該系統(tǒng)中.基于16S rRNA基因序列的PCR-DGGE分析表明,產(chǎn)甲烷絲狀菌屬(Methanosaeta)為該系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,而優(yōu)勢(shì)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為產(chǎn)甲烷螺旋菌屬(Methanospirillum)[11].產(chǎn)甲烷絲狀菌只能利用乙酸作為底物,而產(chǎn)甲烷螺旋菌只能利用H2/CO2作為底物[15-16].為了考察UASB中這兩類產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量,對(duì)它們進(jìn)行了qPCR分析.結(jié)果表明,Methanosaeta的數(shù)量為2.7×10516SrRNA基因拷貝數(shù)/ngDNA.Methanospirillum的數(shù)量比Methanosaeta少了2個(gè)數(shù)量級(jí),只有1.8×10316S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA.已有研究結(jié)果表明,在乙酸含量較低的生物反應(yīng)器中Methanosaeta為優(yōu)勢(shì)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,而且Methanosaeta在顆粒污泥中的含量要高于絮狀污泥[17-18].這可能是由于產(chǎn)甲烷絲狀菌特殊的形態(tài)有利于顆粒污泥形成的原因.

2.2 甲烷生成對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)規(guī)律

定量分析的結(jié)果表明,氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌分別來自產(chǎn)甲烷螺旋菌屬和產(chǎn)甲烷絲狀菌屬.H2/CO2和乙酸不僅是產(chǎn)甲烷菌可利用的主要底物,而且是有機(jī)物厭氧生物處理過程中重要的中間代謝產(chǎn)物.為了了解溫度對(duì)不同營養(yǎng)類型產(chǎn)甲烷菌活性的影響,本研究分別以H2/CO2和乙酸作為底物考察溫度降低對(duì)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌活性的影響.圖1表明,在35℃條件下,接種培養(yǎng)60h后累計(jì)產(chǎn)甲烷量就達(dá)到了最大值24.7mL.當(dāng)溫度從35℃分別降低至30℃和25℃時(shí),甲烷生成速率降低,最終累計(jì)產(chǎn)甲烷量比對(duì)照(35℃)減少了14.2%和34.0%(表1).

當(dāng)溫度分別降低至20℃和15℃時(shí)(圖1),甲烷的生成出現(xiàn)了明顯的停滯期,該停滯期約為24～28h,表明低溫對(duì)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌代謝活性造成了顯著抑制作用.經(jīng)過24～28h的停滯期后,累積產(chǎn)甲烷量開始逐漸增加,表明氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌經(jīng)過24h的適應(yīng),其代謝活性緩慢恢復(fù).累計(jì)產(chǎn)甲烷量最后分別穩(wěn)定在13.1,10.5mL左右.值得注意的是,20和15℃時(shí)的累積產(chǎn)甲烷趨勢(shì)與35,30,25℃時(shí)的累積產(chǎn)甲烷趨勢(shì)明顯不同.20℃和15℃時(shí)出現(xiàn)了明顯的停滯期,更重要的是累積產(chǎn)甲烷量呈線性增加趨勢(shì),而35,30,25℃時(shí)的累積產(chǎn)甲烷量呈現(xiàn)的是先線性增加,后緩慢增加(平臺(tái)期)的趨勢(shì).這2種累積產(chǎn)甲烷趨勢(shì)的不同,意味著在20℃和15℃繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,產(chǎn)甲烷量會(huì)持續(xù)增加,而在35,30,25℃條件下產(chǎn)甲烷量則不會(huì)持續(xù)增加.由此可以看出,低溫對(duì)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的脅迫是通過控制半速度常數(shù)Ks來實(shí)現(xiàn)的.隨著溫度的下降,Ks迅速增加,使得氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)H2/CO2轉(zhuǎn)化速率顯著下降,最終導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的下降.

圖1　不同溫度條件下氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌甲烷產(chǎn)量Fig.1　CH4 production of hydrogenotrophic methanogens at different temperature conditions

表1　不同溫度條件下的產(chǎn)甲烷特征Table 1　Methanogenic characteristics at different temperature conditions

如圖2所示,當(dāng)以乙酸為底物時(shí),產(chǎn)甲烷菌在35℃條件下表現(xiàn)出良好的活性,在接種培養(yǎng)84h后累計(jì)產(chǎn)甲烷量達(dá)到最大值11.7mL.溫度從35℃降低至30,25,20,15℃導(dǎo)致產(chǎn)甲烷速率顯著降低.在30,25,20℃,15℃條件下的累計(jì)產(chǎn)甲烷量比對(duì)照(35 ℃)分別減少了5.1%,23.9%,45.3%,95.7%(表1).

圖2　不同溫度條件下乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌甲烷產(chǎn)量Fig.2　CH4 production of acetotrophic methanogens at different temperature conditions

當(dāng)溫度降低至15℃時(shí)(圖2),甲烷的生成出現(xiàn)了明顯的停滯期,并且該停滯期長(zhǎng)達(dá)96h,表明低溫對(duì)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌代謝活性造成了嚴(yán)重的抑制作用.盡管經(jīng)過了96h的停滯期,累積產(chǎn)甲烷量有所增加,但甲烷產(chǎn)量與35℃時(shí)相比,減少了95.7%.可見,低溫(15℃)對(duì)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌代謝活性造成了長(zhǎng)期的抑制作用.與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌累積產(chǎn)甲烷趨勢(shì)相似,乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌在35,30,25,20℃時(shí)的累積產(chǎn)甲烷量也是先線性增加,后緩慢增加(平臺(tái)期),而在15℃時(shí)出現(xiàn)了96h的停滯期,且隨后累積產(chǎn)甲烷量呈線性增加趨勢(shì).由此可見,低溫對(duì)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的脅迫也是通過控制半速度常數(shù)Ks來實(shí)現(xiàn)的,溫度的下降導(dǎo)致Ks迅速增加,使得乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用乙酸的速率顯著下降,導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的迅速下降.盡管在15℃條件下,乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的活性一直比較低,但如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷細(xì)菌可能適應(yīng)低溫環(huán)境后仍會(huì)表現(xiàn)出一定的產(chǎn)甲烷性能.在以前的研究中,也證實(shí)了這一點(diǎn)[11].

結(jié)合圖1和圖2可以看出,溫度降低對(duì)2種營養(yǎng)類型的產(chǎn)甲烷菌的代謝活性都產(chǎn)生了抑制作用,這是因?yàn)槿魏巫园l(fā)反應(yīng)總是朝著吉布斯自由能減小的方向進(jìn)行,而吉布斯自由能是溫度的狀態(tài)函數(shù),溫度下降會(huì)使吉布斯自由能增加,進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)速率的下降.從不同溫度條件下累積產(chǎn)甲烷趨勢(shì)上可以進(jìn)一步看出,低溫對(duì)兩類產(chǎn)甲烷菌的脅迫是通過控制半速度常數(shù)Ks來實(shí)現(xiàn)的,溫度的下降導(dǎo)致Ks迅速增加,使得兩類產(chǎn)甲烷菌代謝速率顯著下降,導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的迅速下降. Lawrence等[18]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度從35℃降至20 ℃,乙酸鹽轉(zhuǎn)化為甲烷的Ks值從164mg/L增加到了2130mg/L,與本研究的結(jié)果一致.

另外,本研究還發(fā)現(xiàn)溫度降低對(duì)不同營養(yǎng)類型產(chǎn)甲烷菌代謝活性的抑制程度存在差異.在20～30℃時(shí)乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌表現(xiàn)出更好的耐受性,而在15℃以下時(shí)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性,這可能與溫度降低對(duì)2種營養(yǎng)類型的半速度常數(shù)Ks影響程度不同.在20～30℃時(shí),溫度降低對(duì)乙酸產(chǎn)甲烷Ks的影響程度弱于H2/CO2產(chǎn)甲烷Ks,而在15℃以下時(shí)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性.換言之,乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌在低溫條件下微生物活性喪失更快.

2.3 動(dòng)力學(xué)分析

如表2所示,擬合系數(shù)(R2)均大于0.98,表明該模型用來描述累計(jì)產(chǎn)甲烷量的進(jìn)程是合理的. 在35℃條件下,氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的最大產(chǎn)甲烷速率(Rmax)為0.74mL/h,而最大甲烷產(chǎn)量(Pmax)為24.5mL.溫度從35℃分別降至30,25,20,15℃,導(dǎo)致Rmax和Pmax分別減少了58.1%～63.3%和29.5%～58.9%.當(dāng)溫度≥30℃,甲烷生成沒有被延遲,但是溫度≤25℃時(shí),甲烷生成推遲了1.7～28.7h.對(duì)于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌而言,當(dāng)溫度從35℃降低至30,25,20,15℃時(shí),Pmax和Rmax減少2.5%～65.8%和13.5%～92.6%.與對(duì)照(35℃)相比,溫度下降導(dǎo)致λ增加了0.4～7.4倍.

甲烷生成動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明,氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度下降具有更好的適應(yīng)性.因此,在相同溫度條件下,氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的甲烷生成速率高于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌.盡管在15℃條件下,2類產(chǎn)甲烷菌的甲烷生成速率都比較低,但乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌表現(xiàn)出了更長(zhǎng)的遲滯期.該結(jié)果很好解釋了在15～20℃時(shí)UASB反應(yīng)器中氫分壓不會(huì)增加而乙酸出現(xiàn)短時(shí)間積累的原因,這與H?j等[19]前期研究結(jié)果一致.

表3　不同溫度條件下產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)分析Table 3　Kinetic parameters of methane production under different temperatures

3　結(jié)論

3.1 溫度下降可導(dǎo)致氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌活性受到抑制,并且溫度降低對(duì)不同營養(yǎng)類型產(chǎn)甲烷菌活性的抑制程度存在顯著差別.在20～30℃時(shí)乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度脅迫表現(xiàn)出更好的耐受性,而在15℃以下時(shí)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性.

3.2 溫度降低使兩類產(chǎn)甲烷菌的Pmax和λ發(fā)生了顯著變化.氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的Pmax由35℃時(shí)的24.5mL逐漸降低至15℃時(shí)的11.7mL,λ被延長(zhǎng)了1.7～28.7h.而乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Pmax比35

℃條件下減少了2.5%～92.6%,λ被顯著延長(zhǎng),特別是在15℃時(shí)λ達(dá)到了111.8h.

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水厭氧生物處理研究.

Response of methanogens on temperature stress in an UASB reactor.

ZHANG Li-guo1, BAN Qiao-ying1*, LI Jian-zheng2(1.College of Environment and Resource, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1082～1086

Abstract：The effects of temperature stress on different nutrition type methanogens in an upflowed anaerobic sludge blanket (UASB) reactor was investigated by batch culture. The results showed that the dominant hydrogenotrophic and acetotrophic methanogens in this reactor were Methanospirillum and Methanosaeta, respectively. Under 35℃ condition, the accumulative methane production from hydrogenotrophic and acetotrophic methanogens were 24.7 and 11.7mL, separately. And the maximum methane production rate (Rmax) were 0.74 and 0.18mL/h, respectively. Temperature decreases, from 35℃ to 30, 25, 20, 15℃, resulted in accumulative methane productions from hydrogenotrophic methanogens were decreased by 14.2%, 34.0%, 47.0%, 57.5%, respectively. While those from acetotrophic methanogens were reduced by 5.1%, 23.9%, 45.3%, 95.7%, separately. These results indicated that hydrogenotrophic methanogens are more sensitive to temperature tress at 20～30℃, while acetotrophic methanogens are more sensitive at ≤15℃.

Key words：UASB reactor；methanogens；temperature stress；methane production

作者簡(jiǎn)介：張立國(1980-),男,河南安陽人,講師,博士,主要從事廢

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51508316);山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2015021136,2015021134)

收稿日期：2015-09-18

中圖分類號(hào)：X703.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)04-1082-05