何首烏肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)探索研究

楊敏　劉婷　馮偉紅　回連強(qiáng)　李嬈嬈　劉曉謙　陳安家　李春　王智民

[摘要]通過觀察何首烏中蒽醌類成分對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并通過精密肝切片技術(shù)對(duì)細(xì)胞毒成分進(jìn)行驗(yàn)證，探討何首烏致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。運(yùn)用MTT法檢測(cè)何首烏中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌及柰類共11個(gè)單體成分對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。將有明確細(xì)胞毒的成分與大鼠肝切片共同培養(yǎng)6 h后制備肝組織勻漿，通過BCA 法測(cè)定勻漿液中蛋白含量，連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定并計(jì)算每1 μg蛋白中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ谷氨酰氨基轉(zhuǎn)肽酶（GGT）和乳酸脫氫酶（LDH）的漏出率，以考察這些成分對(duì)肝組織的毒性作用。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有大黃酸、大黃素、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黃素甲醚8O（6′O乙?；│翫葡萄糖苷顯示一定的細(xì)胞毒作用，其IC50分別為7107，12562，24227，40232 μmol·L-1，而其他7個(gè)化合物的毒性很小。肝切片試驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃酸400 μmol·L-1組能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<001），100 μmol·L-1組能引起肝切片 LDH漏出率的顯著升高（P<005）；隨藥物濃度增大，肝切片中蛋白含量顯著下降（P<005），顯示有一定的量毒關(guān)系。大黃素400 μmol·L-1組可引起肝切片ALT，GGT，LDH漏出率的顯著升高（P<001）。大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷800 μmol·L-1組能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<001或P<005），200 μmol·L-1組能引起肝切片LDH漏出率的顯著升高（P<005）；且隨藥物濃度的增大肝切片中ALT，AST，LDH漏出率呈升高趨勢(shì)，蛋白含量呈下降趨勢(shì)。此外，濃度為800 μmol·L-1的大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷還可使肝切片MTT還原能力顯著下降（P<001）。結(jié)果提示，大黃酸、大黃素及大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷只有在高濃度（≥400 μmol·L-1）時(shí)才可能對(duì)肝組織產(chǎn)生一定的損害作用。但是，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這3個(gè)成分的體內(nèi)暴露水平都很低，要達(dá)到毒性濃度（400 μmol·L-1或800 μmol·L-1）的暴露水平，轉(zhuǎn)化為健康成人至少分別需要單次口服4 898，339，5 581 g的何首烏藥材，這與何首烏的臨床使用劑量（生首烏3～6 g，制首烏6～12 g）相差甚遠(yuǎn)，因此，“蒽醌類成分是何首烏肝毒性成分”這一說法是缺乏科學(xué)依據(jù)的。

[關(guān)鍵詞]何首烏；蒽醌類成分；肝細(xì)胞毒性；精密肝切片技術(shù)；肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)

[Abstract]By observing the cytotoxic effects of anthraquinones on HepG2 cell and using the precisioncut liver slices technique to authenticate the cytotoxic constituents， the paper aims to explore the material basis of Polygonum multiflorum root to cause liver toxicity Firstly， MTT method was used to detect the effect of 11 anthraquinone derivatives on HepG2 cell Then， the clear cytotoxic ingredients were cocultured with rat liver slices for 6h respectively， and the liver tissue homogenate was prepared BCA method was used to determine the content of protein in the homogenate and continuous monitoring method was used to monitor the leakage of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， gammaglutamine amino transpeptidase （GGT） and lactate dehydrogenase （LDH） The toxic effect of these ingredients on liver tissue was tested by calculating the leakage rate of the monitored enzymes As a result， rhein， emodin， physcion8OβDglucopyranoside and physcion8O（6′Oacetyl）βDglucopyranoside showed cytotoxic effects on HepG2 cell and their IC50 values were 7107， 12562， 24227， 40232 μmol·L-1 respectively， but the other 7 compounds are less toxic and their IC50 values can not be calculated The precisioncut liver slices tests showed that rhein group of 400 μmol·L-1 concentration significantly increased the leakage rate of ALT， AST and LDH （P<001）， and the rhein group of 100 μmol·L-1 concentration only increased the leakage rate of LDH （P<005） With the increase of rhein concentration， the protein content in liver slices decreased significantly （P<005） with a certain range of does Emodin group of 400 μmol·L-1 concentration significantly increased the leakage rate of ALT， GGT and LDH （P<001） Physcion8OβDglucopyranoside group of 800 μmol·L-1 concentration also significantly increased the leakage rate of ALT， AST and LDH （P<001 or P<005）， but the group of 200 μmol·L-1 concentration only significantly increased the LDH leakage （P<005） Along with the increase of the concentration of physcion8OβDglucopyranoside， the leakage rate of ALT， AST and LDH showed a trend of increase， but the protein content in liver slices was in decline Furthermore， MTT reduction ability of liver slices significantly decreased （P<001） in the physcion8OβDglucopyranoside group of 800 μmol·L-1 concentration The results suggested that rhein， emodin and physcion8OβDglucopyranoside at high concentrations （≥400 μmol·L-1） can produce some damage to the liver tissue However， the exposure levels of these constituents are very low， so to reach the toxic concentration （400 μmol·L-1 or 800 μmol·L-1） an adult of 65 kg body weight will need at least a single oral 4 898 g， 339 g and 5 581 g of Pmultiflorum root respectively， which is far from the statutory dose of crude P multiflorum root （36 g） or its processed product （612 g） Therefore， the conclusion that anthraquinones are the prime constituents of the hepatotoxicity of P multiflorum root are still not be proved

[Key words]Polygonum multiflorum root； anthraquinones； hepatoxicity； precisioncut liver slices technique； hepatoxic constituents

doi：10.4268/cjcmm20160721

何首烏始載于唐元和七年（公元813年）李翱《何首烏錄》[1]，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便、補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂等功效[2]，在醫(yī)療、保健及美容方面應(yīng)用極其廣泛。近年來何首烏及相關(guān)制劑引起肝毒性的報(bào)道日益增多[37]，其安全性問題引起了廣泛的關(guān)注。何首烏導(dǎo)致肝毒性的原因到底是外源性因素還是內(nèi)源性因素，迄今尚無令人信服的結(jié)論。從內(nèi)源性因素看，主流觀點(diǎn)認(rèn)為是其中的某些化學(xué)成分或其代謝物對(duì)肝細(xì)胞可能有一定毒性。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，何首烏醇提物和水提物均可造成肝損傷[810]，且醇提物的毒性相對(duì)較大[1113]。何首烏中主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類及磷脂類等化學(xué)成分[14]。與水提物相比，醇提物中的蒽醌類成分較多[1516]；故而現(xiàn)階段多認(rèn)為“蒽醌致毒”[1719]，進(jìn)而聚焦于游離蒽醌上，如大黃素、 大黃酸作為主要貢獻(xiàn)者[18]；用LCMS研究肝臟L02細(xì)胞對(duì)大黃素的攝取和蓄積時(shí)發(fā)現(xiàn)，大黃素可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并在細(xì)胞中蓄積之后產(chǎn)生毒性作用[19]；通過肝細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，制首烏組及大黃酚組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與空白對(duì)照組比較有明顯增加，從而得出大黃酚有可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的主要成分的結(jié)論[20]。

與上述結(jié)論矛盾的是，大量數(shù)據(jù)顯示“生首烏毒性大于制首烏”[2123]，而制首烏中的游離蒽醌含量又遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生首烏，蒽醌苷卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生首烏[24]；若“游離蒽醌致毒”的話，邏輯上制首烏的肝毒性應(yīng)大于生首烏，與事實(shí)不符；再者，大黃的蒽醌含量遠(yuǎn)高于何首烏，為何其毒性較低，也側(cè)面說明“游離蒽醌致毒”一說的依據(jù)不足。此外，雖有零星報(bào)道何首烏中結(jié)合蒽醌（大黃素8OβD葡萄糖苷[25]）對(duì)肝細(xì)胞的作用，但至今未見肝毒性報(bào)道，因此“蒽醌苷類致毒”一說也存在較大疑問。

為此，作者對(duì)何首烏主要蒽醌類成分進(jìn)行細(xì)胞毒性篩選，通過觀察游離蒽醌及其苷對(duì)HepG2細(xì)胞作用來篩選有肝細(xì)胞毒作用的成分，并從構(gòu)毒關(guān)系上找出規(guī)律；再通過精密肝切片技術(shù)對(duì)有確切細(xì)胞毒的成分進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)“蒽醌致毒”的真實(shí)性，為何首烏臨床安全用藥提供依據(jù)。

1材料

大黃酚，大黃酸，蘆薈大黃素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110796201017，110757200206，110795201007）；大黃酚8OβD葡萄糖苷，大黃素1OβD葡萄糖苷，決明酮8OβD葡萄糖苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)分別為150114，141211，150302）；大黃素甲醚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)D00414072）；大黃素，大黃素8OβD葡萄糖苷，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷，大黃素甲醚8O（6′O乙?；│翫葡萄糖苷由本實(shí)驗(yàn)室自制獲得，通過NMR和MS鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC檢測(cè)其純度均大于98%?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

MEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司，LotNo 1707776）；胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco 公司，Lot No 1414426）；DMEM培養(yǎng)液（美國(guó) Gibco公司，LotNo 8115143）；025% TrypsinEDTA（美國(guó)Gibco 公司，LotNo 1638591）；PBS（Solarbio公司，LotNo 20150408）；二甲基亞砜（DMSO）和MTT為Solarbio公司產(chǎn)品。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、γ谷氨酰氨基轉(zhuǎn)肽酶試劑盒（北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為GG5101A，GG5104A，XJ5105B，GG5103A）；瓊脂糖（英國(guó)OXOID limited 公司，批號(hào)84867402）；BCA法微量蛋白測(cè)試盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)20151204）。

Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，HERA Cell CO2培養(yǎng)箱 （德國(guó)），超凈工作臺(tái) （北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司）；BCD286超低溫冰箱（博西華家用電器有限公司）；Startorious BT125D電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；純水儀（美國(guó)Millipore公司）；DSZ5000x倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；低速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；1000 Plus Vibracome 振蕩切片機(jī)（英國(guó)），Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)），東芝TBA40FR全自動(dòng)生化分析儀。

HepG2 細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

SD大鼠，雄性，體重180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào) SCXK（京）20120001。

2方法

21細(xì)胞毒性試驗(yàn)

211藥品配制分別精密稱取大黃素27 mg，蘆薈大黃素 27 mg，大黃酚25 mg，大黃素甲醚28 mg，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷45 mg，大黃素甲醚8O（6′O乙?；│翫葡萄糖苷49 mg，大黃素1OβD葡萄糖苷43 mg，大黃酸28 mg，大黃素8OβD葡萄糖苷43 mg，大黃酚8OβD葡萄糖苷42 mg，決明酮8OβD葡萄糖苷41 mg，各加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL 溶解，備用。在無菌、避光條件下將配好的母液用含10% FBS的MEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，分別裝入滅菌后的 EP管中，混勻。其中，大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黃素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷、大黃素1OβD葡萄糖苷7個(gè)成分的母液經(jīng)倍比稀釋后分別配制成濃度為400，100，25，625 μmol·L-1的樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。大黃酸、大黃素8OβD葡萄糖苷、大黃酚8OβD葡萄糖苷和決明酮8OβD葡萄糖苷4個(gè)成分的母液經(jīng)倍比稀釋后分別配制成濃度為400，100，25，625，156，039 μmol·L-1的樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。以上樣品溶液中DMSO的終濃度均為04%。

212細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞用含10% FBS的MEM培養(yǎng)液置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí)采用消化法傳代。傳代時(shí)，倒掉舊的培養(yǎng)基，再用MEM洗1～2次，加入025% TrypsinEDTA 1 mL，消化大約3 min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞相互分離，胞質(zhì)回縮，胞體變圓后，立即加含血清培養(yǎng)基2～3 mL終止消化，用彎頭吸管按部位輕輕吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁，最后將吸管尖部置于瓶底一角上下吹打數(shù)次，形成細(xì)胞懸液。再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，500 r·min-1離心5 min，離心完畢，棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液分裝至 2～3個(gè)新培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

213MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用胰酶消化處于對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，終止消化后離心，收集細(xì)胞將其制成懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至2×105個(gè)/mL，接種于 96 孔板中，每孔加入200 μL細(xì)胞混懸液，置 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底。然后將96孔板中的培養(yǎng)液吸走，加入不同濃度的藥物（每一濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，每孔加入藥液150 μL ），同時(shí)設(shè)置空白組（加含10% FBS的MEM培養(yǎng)液）及對(duì)照組（加含04% DMSO的10% FBS 的MEM培養(yǎng)基）。置 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后取出 96 孔板，吸棄剩余培養(yǎng)液，每孔加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將上清液去掉，每孔加入200 μL DMSO，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸收度（A），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對(duì)照組×100%。

22采用大鼠精密肝切片考察3個(gè)成分的體外肝毒性

將 SD 大鼠斷頭處死，在無菌條件下取出肝臟，按文獻(xiàn)方法制備肝切片[26]，切片厚度為200 μm。 將含大黃酸25，100，400 μmol·L-1，大黃素25，100，400 μmol·L-1及大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷50，200，800 μmol·L-1的DMEM 培養(yǎng)液分別與肝切片共同培養(yǎng)于24孔板中，肝切片1片/孔，在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h 。

221MTT還原能力培養(yǎng)6 h后取出培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔加 1 g·L-1 MTT 1 mL，37 ℃ 振蕩孵育 1 h，棄上清，每片肝切片再加1 mL DMSO，37 ℃振蕩溶解1 h，上清 570 nm 處測(cè)A，肝切片稱重，計(jì)算A除以肝切片質(zhì)量（g）。

222生化指標(biāo)肝切片用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿液，參照試劑盒說明書 BCA 法測(cè)定蛋白含量，全自動(dòng)生化分析儀連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定上清液及肝切片勻漿液中ALT，AST，GGT，LDH活性，BCA 蛋白分析法測(cè)定上述勻漿液中的蛋白含量，按文獻(xiàn)[26]方法計(jì)算每1 μg蛋白中ALT，AST，GGT，LDH的漏出率。

23統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 180 軟件做t檢驗(yàn)， IC50采用Probit回歸擬合。P<005為有顯著性差異，P<001為有極顯著性差異。

3結(jié)果

31細(xì)胞毒性試驗(yàn)

何首烏中11個(gè)單體成分對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，2。結(jié)果顯示，只有大黃酸、大黃素、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黃素甲醚8O（6′O乙?；│翫葡萄糖苷對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用，而其他化合物的細(xì)胞毒作用則很小，無法計(jì)算出IC50；而且有的化合物如大黃素1OβD葡萄糖苷則對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用；此外，大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素8OβD葡萄糖苷和大黃酚8OβD葡萄糖苷高濃度時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)為抑制作用，而低濃度時(shí)則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相吻合[1718， 27]。

32精密肝切片試驗(yàn)

大黃酸25，100，400 μmol·L-1與肝切片共培養(yǎng) 6 h 后，400 μmol·L-1組能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<001），100 μmol·L-1能引起肝切片 LDH漏出率的顯著升高（P<005）；隨藥物濃度增大，蛋白含量顯著下降（P<005），且顯示一定的量毒關(guān)系。大黃素25，100，400 μmol·L-1與肝切片共培養(yǎng) 6 h 后，400 μmol·L-1組可引起肝切片ALT，GGT，LDH漏出率的顯著升高（P<001）。大黃酸和大黃素對(duì)肝切片MTT還原能力均無明顯影響。大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷50，200，800 μmol·L-1與肝切片共培養(yǎng)6 h 后，800 μmol·L-1能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<001或P<005）；200 μmol·L-1能引起肝切片LDH漏出率的顯著升高（P<005），且隨藥物濃度的增大肝切片ALT，AST，LDH漏出率呈升高趨勢(shì)，蛋白含量呈下降趨勢(shì)。濃度為800 μmol·L-1的大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷與肝切片共培養(yǎng)6 h后MTT還原能力顯著下降（P<001），見表3。

4討論

近年來，何首烏的肝毒性問題已引起了世界各國(guó)廣泛的關(guān)注，而探究其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)成了學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究就這一焦點(diǎn)問題進(jìn)行了探討。

何首烏中主要含有二苯乙烯苷類和蒽醌衍生物兩大類成分。本實(shí)驗(yàn)所研究的11個(gè)化合物都有從何首烏中分離得到的文獻(xiàn)報(bào)道[14]，并且其中的10個(gè)蒽醌單體被認(rèn)為是何首烏中的主要蒽醌類成分[28]。

HepG2 細(xì)胞來源于人肝胚細(xì)胞瘤，其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性，其分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶，是研究藥物肝毒性常用的細(xì)胞模型之一[2930]。與蒽醌類化合物比較，決明酮8OβD葡萄糖苷對(duì)HepG2細(xì)胞基本無毒，據(jù)此推測(cè)具有蒽醌類母核的化合物更易產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

游離蒽醌成苷后肝細(xì)胞毒作用到底是增大還是減少不能一概而論，還需要具體化合物具體分析。與大黃素相比，大黃素8OβD葡萄糖苷和大黃素1OβD葡萄糖苷的肝細(xì)胞毒性明顯降低，而且成苷位置不同，其對(duì)細(xì)胞的影響也不同：大黃素R4位OH成苷后，肝細(xì)胞毒性有所降低；但當(dāng)R1位成苷時(shí)，其對(duì)HepG2細(xì)胞不僅沒有抑制作用，反而可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。與大黃酚相比，同等濃度下大黃酚8OβD葡萄糖苷的肝細(xì)胞毒性也有所降低。但是，與大黃素甲醚相比，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黃素甲醚8O（6′O乙?；│翫葡萄糖苷對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性則均有所增加。

11 個(gè)化合物中，大黃酸的毒性相對(duì)最強(qiáng)，而這11個(gè)化合物中只有大黃酸R2位上有羧基，因此推測(cè)羧基的存在可大大增強(qiáng)蒽醌母核的肝細(xì)胞毒性。

大黃素、大黃素甲醚和大黃酚三者的結(jié)構(gòu)只有R3取代基有差別，而它們對(duì) HepG2細(xì)胞的毒性為大黃素>大黃素甲醚≈大黃酚，由此說明就對(duì)肝細(xì)胞毒性而言，取代基對(duì)蒽醌類化合物的細(xì)胞毒性貢獻(xiàn)由大到小依次為OH>H≈OCH3。此外，大黃酸、大黃酚及蘆薈大黃素結(jié)構(gòu)上只有R2取代基不同， 其對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性由大到小依次為大黃酸>大黃酚>蘆薈大黃素，由此推測(cè)蒽醌化合物中取代基對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用影響由大到小為COOH>CH3>CH2OH。文獻(xiàn)通過比較大黃酸和蘆薈大黃素的活性，得出R2位取代基吸電子能力越強(qiáng)，對(duì)人肝癌細(xì)胞抑制作用越強(qiáng)的結(jié)論[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吸電子官能團(tuán)對(duì)蒽醌類化合物的肝毒性有一定影響，但并不完全符合該規(guī)律。

此外，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大黃酸和大黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性最強(qiáng)，其次為大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黃素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷，這4個(gè)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用均隨濃度的增高而增大，且在高濃度作用下有明顯的細(xì)胞毒作用。而大黃素、大黃酸、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷的毒性相對(duì)較強(qiáng)，因此，作者采用精密肝切片技術(shù)對(duì)這3個(gè)成分的肝毒性進(jìn)行了深入研究。

精密肝切片技術(shù)是介于器官與細(xì)胞水平之間的體外實(shí)驗(yàn)手段，其保存了一定的組織結(jié)構(gòu)，保留了所有類型的細(xì)胞、細(xì)胞間聯(lián)系及各種肝藥酶的活性。相對(duì)于細(xì)胞水平，更具宏觀性與整體性，能較好地模擬體內(nèi)的肝環(huán)境，可反映藥物在體內(nèi)的實(shí)際代謝過程 ，具有簡(jiǎn)單、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)[32]。ALT和AST是目前最常用的反映肝功能損害最敏感的指標(biāo)，ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)， 而AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中。當(dāng)細(xì)胞膜通透性增大時(shí)， ALT漏出率增加；而當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重病變壞死時(shí)，線粒體內(nèi)AST便釋放出來。GGT在肝內(nèi)由肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生，其主要分布在肝細(xì)胞膜及毛細(xì)膽管上皮， LDH是體內(nèi)能量代謝過程中的一個(gè)重要的酶；當(dāng)肝細(xì)胞損傷或壞死時(shí)，細(xì)胞膜受到損傷，GGT和 LDH的漏出率就會(huì)升高[3334]。臨床上觀察何首烏導(dǎo)致肝功能損害的患者其肝生化指標(biāo)特點(diǎn)為ALT 和AST 均顯著升高，同時(shí)也伴有GGT及LDH的升高[3537]。此外，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明大鼠灌胃不同劑量的何首烏后，其血清ALT 和AST均有不同程度的升高；劑量越大、給藥時(shí)間越長(zhǎng)其升高程度越明顯[8，3839]。精密肝切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的大黃酸與肝切片共培養(yǎng) 6 h 后，400 μmol·L-1組可使ALT，AST，LDH漏出率增加，100 μmol·L-1可使 LDH漏出率升高；且隨藥物濃度的增大蛋白含量顯著下降，且顯示一定的毒效關(guān)系。濃度為400 μmol·L-1的大黃素可引起ALT，GGT，LDH的漏出率增加。由此說明大劑量的大黃酸、大黃素在體外對(duì)肝組織均可表現(xiàn)出一定的毒性。大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷濃度為200 μmol·L-1時(shí)能引起肝切片LDH漏出率的顯著升高；濃度增大至800 μmol·L-1時(shí)肝切片ALT，AST，LDH的漏出率顯著升高；同時(shí)，隨藥物濃度的增大這3種酶的漏出率呈升高趨勢(shì)且蛋白含量呈下降趨勢(shì)。通過肝切片MTT實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，肝切片與濃度為800 μmol·L-1的大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷共培養(yǎng)6 h后其MTT還原能力顯著下降。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及精密肝切片實(shí)驗(yàn)均證明大黃酸、大黃素及大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷在大劑量時(shí)存在一定的肝毒性，該結(jié)果表明部分蒽醌對(duì)體外肝細(xì)胞及肝組織確實(shí)可產(chǎn)生一定的損害作用。但是，通過對(duì)何首烏中大黃酸、大黃素及大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷的含量進(jìn)行總結(jié)得知：何首烏中大黃酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0～0023 2%；大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0000 7%～0319%；大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0014%～0064%[29，4046]。而且有文獻(xiàn)報(bào)道志愿者按50 mg·kg-1（相當(dāng)于大黃生藥035 g·kg-1）單次口服大黃水提物，HPLC測(cè)定每克水提物中大黃酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1230 8%，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)大黃酸在人體內(nèi)的最大血藥濃度為1428 μmol·L-1 [47]。由此可知65 kg的志愿者單次口服大黃酸的量為141 μmol，進(jìn)而推算出人體的表觀分布容積約為10 L?；颊叻煤问诪醯膭┝看蟛糠譃槌Ｒ?guī)劑量[6，48]，藥典規(guī)定生首烏的用量為3～6 g，制首烏的用量為6～12 g[2]，若按最大劑量12 g服用何首烏（大黃酸按最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)0023 2%計(jì)算，大黃素按最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)0319%計(jì)算，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷按最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)0064%計(jì)算），則大黃酸、大黃素和大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷暴露于體內(nèi)的最大濃度應(yīng)分別為098，1416，172 μmol·L-1，若要達(dá)到體外實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生肝毒性的濃度（大黃酸和大黃素為400 μmol·L-1，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷為800 μmol·L-1），則需要分別單次服用4 898，339，5 581 g何首烏藥材，而這顯然是不合理和不可能實(shí)現(xiàn)的。因此，“蒽醌類成分是何首烏肝毒性成分”的說法是缺乏科學(xué)證據(jù)支持的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王智民. 對(duì)何首烏基原和品種的再認(rèn)識(shí)[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（22）：3988.

[2]中國(guó)藥典. 一部 [S]. 2015：175.

[3]Kyoung A J，Hyun J M，Seung S Y，et al. Druginduced liver injury：twenty five cases of acute hepatitis following ingestion of Polygonum multiflorum Thunb[J]. Gut And Liver，2011，5（4）：493.

[4]Lei X，Chen J，Ren J T，et al. Liver damage associated with Polygonum multiflorum Thunb.：a systematic review of case reports and case series[J]. Evid Based Compl Alt，2015，doi：101155/2015/459749.

[5]孫震曉，張力. 何首烏及其制劑相關(guān)肝損害國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)回顧與分析[J]. 藥物不良反應(yīng)雜志，2010，12（1）：26.

[6]張艷，陳爽，盧磊. 何首烏致藥物性肝損傷36例臨床分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)，2013，24（2）：235.

[7]徐靜，汪茂榮，何長(zhǎng)倫，等. 口服何首烏致肝損害40例臨床分析[J]. 東南國(guó)防醫(yī)藥，2009，11（3）：209.

[8]黃偉，張亞囡，孫蓉. 何首烏不同組分單次給藥對(duì)小鼠肝毒性“量時(shí)毒”關(guān)系研究[J]. 中國(guó)藥物警戒，2011，8（4）：193.

[9]Choi Y J，Yoon Y，Choi H S，et al. Effects of medicinal herb extracts and their components on steatogenic hepatotoxicity in Skhep1 cells[J]. Toxicol Res，2011，27（4）：211

[10]胡錫琴，耿增巖，李巧蘭，等. 制何首烏不同劑量與大鼠肝損傷程度的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陜西中醫(yī)，2007，28（10）：1420.

[11]李奇，趙奎君，趙艷玲，等. 大劑量何首烏醇提物致大鼠多臟器損傷研究[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（1）：1.

[12]呂旸，王伽伯，嵇揚(yáng)，等. 提取溶劑對(duì)何首烏肝細(xì)胞毒性的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（20）：268.

[13]黃偉，張亞囡，孫蓉. 何首烏不同組分對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)比較研究[J]. 中國(guó)藥物警戒，2010，7（12）：705.

[14]Lin L F，Ni B，Lin H M，et al. Traditional usages，botany，phytochemistry，pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb. ：a review[J]. J Ethnopharmacol，2014，159（22）：158.

[15]董金香，賈艾玲，董雪蓮，等. 何首烏藥材中蒽醌類成分的提取工藝研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：150.

[16]陳小蕾，吳立強(qiáng)，陳小雨. 不同溶劑所制何首烏浸膏中所含游離蒽醌的含量比較[J]. 海南醫(yī)學(xué)，2003，14（12）：119.

[17]張瑞晨，劉斌，孫震曉，等. 何首烏提取物對(duì)人正常肝細(xì)胞L02周期阻滯及凋亡的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2010，8（6）：554.

[18]孫向紅，孫玉維，李紅，等. 何首烏主要成分大黃素、大黃酸和二苯乙烯苷對(duì)肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19（11）：1315.

[19]Li C L，Jiang M，Li Z，et al. Determination of emodin in L02 cells and cell culture media with liquid chromatographymass spectrometry：application to a cellular toxicokinetic study[J]. J Pharmaceut Biomed，2012，71（12）：71.

[20]衛(wèi)培峰，黨艷麗，焦晨莉，等. 何首烏不同成分與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J]. 陜西中醫(yī)，2009，30（2）：238.

[21]Wu X，Chen X，Huang Q，et al. Toxicity of raw and processed roots of Polygonum multiflorum[J]. Fitoterapia，2011，83（3）：469.

[22]李玥，徐立，劉若囡，等. 生、制首烏醇提物對(duì)小鼠肝臟的影響[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，17（4）：452.

[23]涂燦，蔣冰倩，趙艷玲，等. 何首烏炮制前后對(duì)大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標(biāo)篩選[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（4）：654.

[24]Liang Z，Chen H，Yu Z，et al. Comparison of raw and processed Radix Polygoni Multiflori （Heshouwu） by high performance liquid chromatography and mass spectrometry[J]. Chin Med，2010，5（5）：29.

[25]李登科，李寶賽，崔寶弟，等. 何首烏中大黃素8OβD葡萄糖苷的分離純化與體外抗癌活性研究[J]. 癌變·畸變·突變， 2014，26 （6）：401.

[26]回連強(qiáng)，高雙榮，劉婷，等. 基于精密肝切片技術(shù)的野百合堿體外肝毒性初步研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2011，36（5）：628.

[27]王青秀. 大黃及其主要成份的毒性毒理研究[D]. 北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2007.

[28]Tao Y，Leung K S Y，Lu G H，et al. Identification and determination of the major constituents in traditional Chinese medicinal plant Polygonum multiflorum thunb by HPLC coupled with PAD and ESI/MS[J]. Phytochem Anal，1990，18（3）：181.

[29]O′Brien P J，Irwin W，Diaz D，et al. High concordance of druginduced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cellbased model using high content screening[J]. Arch Toxicol，2006，80（9）：580.

[30]Noor F，Niklas J V U. An integrated approach to improved toxicity prediction for the safety assessment during preclinical drug development using Hep G2 cells[J]. Toxicol Appl Pharm，2009，237（2）：221.

[31]肖軍軍，萬峰，鄭俊華，等. 大黃蒽醌衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞和小鼠腹水肝癌細(xì)胞的殺傷作用[J]. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，25（增刊5）：76.

[32]周璐，喬靜怡，金若敏. 精密肝切片技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用[J]. 中成藥，2013，35（6）：1292.

[33]蘇炳森. 生化指標(biāo)在肝病診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（3）：120.

[34]王愛莉，李曉斐. 常用血生化指標(biāo)檢測(cè)在各種肝病診斷中的應(yīng)用[J]. 實(shí)用肝臟病雜志，2007，10（1）：43.

[35]楊興祥，江南，林建梅. 何首烏致肝損害13例臨床分析[J]. 四川醫(yī)學(xué)，2008，29（12）：1619.

[36]陳仕祥，陳璽卿，江軍，等. 何首烏致藥物性肝病12例分析[J]. 中國(guó)誤診學(xué)雜志，2010，10（19）：4759.

[37]宋良玉. 何首烏所致藥物性肝炎的相關(guān)分析[J]. 西部醫(yī)學(xué)，2011，23（7）：1300.

[38]涂燦，蔣冰倩，趙艷玲，等. 何首烏炮制前后對(duì)大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標(biāo)篩選[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（4）：654.

[39]李衛(wèi)先，張琦，王國(guó)仁，等. 何首烏不同炮制品致肝損害的研究[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2012，27（5）：129.

[40]羅益遠(yuǎn)，劉娟秀，劉訓(xùn)紅，等. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定何首烏中7種指標(biāo)成分含量的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50（9）：802.

[41]朱培芳，趙紫偉，趙榮華. 高效液相色譜法測(cè)定12個(gè)市售地何首烏中有效成分的含量[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（11）：3605.

[42]郭青，魯靜. 高效液相色譜法測(cè)定何首烏及其炮制品中蒽醌類成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2000，20（5）：326.

[43]朱蓮華，王智華. 不同產(chǎn)地何首烏的質(zhì)量分析[J]. 中成藥，1999，21（1）：36.

[44]付衛(wèi)華. HPLC法測(cè)定何首烏炮制過程中主要化學(xué)成分含量[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（7）：50.

[45]彭貴龍，周光明，楊遠(yuǎn)高，等. 高效液相色譜同時(shí)測(cè)定何首烏中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，51（2）：349.

[46]陳慶堂，卓麗紅，徐文，等. 何首烏炮制過程中5種化學(xué)成分的含量變化[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：66.

[47]朱偉，阮新民，陳可冀. 性別差異對(duì)大黃酸在人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程的影響[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11（2）：223.

[48]燕玉清. 持續(xù)小劑量口服何首烏致肝損害一例[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志，2011， 23（5）：41.

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