藏柴胡中三萜皂苷類成分的研究

方偉　楊印軍　郭寶林　岑山

[摘要]該研究主要探究藏柴胡中的三萜皂苷類成分。采用大孔吸附樹脂，MCI，硅膠，ODS，MDS柱色譜以及半制備高效液相色譜等分離純化方法，從藏柴胡70%乙醇（含05% 氨水）提取物中得到12個化合物。利用高分辨質譜、核磁共振等波譜手段鑒定其結構分別為柴胡皂苷 b2 （1），柴胡皂苷 a （2），柴胡皂苷 b1 （3），柴胡皂苷 d（4），hydroxysaikosaponin a（5），柴胡皂苷 b3（6），柴胡皂苷 c （7），柴胡皂苷 i （8），柴胡皂苷 f （9）， chikusaikosides Ⅱ（10），柴胡皂苷 s（11），柴胡皂苷 I（12）。12個化合物均屬齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，其中化合物1，3，5，8～9，11～12均為首次從該植物中分離得到。體外抗流感病毒實驗表明在20 μmol·L-1下，化合物2，4，6，8，11～12對流感病毒WSN33具有較明顯抑制作用，其抑制率分別為913%，886%，534%，613%，773%，574% 。

[關鍵詞]窄竹葉柴胡；三萜皂苷；齊墩果烷型

[Abstract]Twelve compounds were obtained by phytochemical investigation of 70% EtOH （ containing 05%NH3·H2O ）extract of the roots of Bupleurum marginatum var stenophyllum Based on comparison of their spectral data， including HRESIMS，1HNMR，13CNMR data，with those of the literature， their structures were elucidated as saikosaponin b2 （1）， saikosaponin a（2）， saikosaponin b1（3）， saikosaponin d （4）， hydroxysaikosaponin a （5）， saikosaponin b3 （6）， saikosaponin c（7），saikosaponin i （8）， saikosaponin f （9）， chikusaikosides Ⅱ（10）， saikosaponin s （11）， and saikosaponin I（12） All compounds belong to oleantype triterpenoid saponin and compounds 1， 3， 5， 89，11， and 12 were isolated from this plant for the first time At a concentration of 20 μmol·L-1， compounds 2， 4， 6， 8， 11 and 12 showed strong inhibition activity against influenza virus WSN33 with the inhibition rate of 913%，886%，534%，613%，773% and 574%，respectively

[Key words]Bupleurum marginatum var stenophyllum； triterpenoid saponin； oleantype

doi：10.4268/cjcmm20160716

近幾年甘肅渭源等地的藥材種植戶引種了一種高產柴胡，流通名稱叫“藏柴胡”，經鑒定來源于傘形科植物窄竹葉柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff）Shan et Y. Li的干燥根，該植物為竹葉柴胡B. marginatum的變種[1]，分布于我國西部和西南部的2 700 m以上的高海拔地區(qū)，在我國貴州省藥材標準中以“竹葉柴胡”的名稱收載[2]，當?shù)貙嶋H作柴胡使用。因為種植產量大和柴胡皂苷含量高，已經在甘肅、山西、陜西等地種植，在我國華北和西北地區(qū)有廣泛的適應性，大有迅猛蔓延之勢，對我國未來柴胡藥材的資源格局將產生巨大的影響，非常有必要對該物種的栽培品進行系統(tǒng)的研究，以及和正品柴胡之間的比較，并進一步確認其有效性和毒性等。文獻調研顯示同柴胡屬其他植物一樣，本物種也主要含有皂苷類成分。本文報道了該物種系統(tǒng)化學分離工作的一部分，即分離得到的12個皂苷類成分，及其抗流感病毒活性。

1材料

Bruker AV 600 型核磁共振波譜儀，內標為 TMS；LTQObitrap XL 質譜儀（賽默飛世爾）；Agela CHEETAHTM中壓制備液相色譜儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）；Waters 高效液相色譜儀，包括 Waters 2535 型泵、Waters 2998 檢測器、Empower Ⅲ色譜工作站（美國Waters公司）；柱色譜用硅膠（60～100，100～200，300～400目）及薄層色譜硅膠 GF254（青島海洋化工廠）；ODSAQ（50μm）（日本YMC公司）；MCI GEL 和 MDS GEL（75 ～ 150μm）（日本三菱司）；D101 大孔樹脂（滄州寶恩化工有限公司）；Unitary C18半制備色譜柱（中國華譜新創(chuàng)科技有限公司）；色譜級甲醇、乙腈（西隴化工股份有限公司），實驗室所用其他試劑均為分析純 ；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司），DMEM，含EDTA的025% 胰酶，F(xiàn)BS（Invitrogen公司）。

藏柴胡于2014年7月購買自甘肅渭源，經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為窄竹葉柴胡B. marginatum var. stenophyllum的干燥根，標本保存于本課題組。

2提取分離

82 kg藏柴胡干燥根粉碎后用10倍量加熱至沸的70%乙醇（含05%氨水）浸泡提取2次，每次48 h。合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加水分散后上大孔樹脂柱D101，分別用10%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，棄去10%乙醇洗脫部位，95%乙醇洗脫部位為總皂苷（400 g）。取總皂苷300 g拌樣上MCI柱，分別用20%，40%，60%，90%，100%甲醇梯度洗脫。90%甲醇洗脫部位（150 g）拌樣上硅膠色譜柱（200～300目）分離，用二氯甲烷甲醇梯度洗脫（25∶1～0∶1），經TLC檢測后合并相同組分得到7個流分（A～G）。其中流分F經重結晶后得到化合物1（200 mg）。流分D經中壓ODS分離（50%甲醇～100%甲醇）得到4個流分（D1～D4），其中流分D2經HPLC制備分離（80% 甲醇）得到化合物2（13 mg）。60%甲醇洗脫部位（120 g）再拌樣上硅膠色譜柱（200～300目）分離，用二氯甲烷甲醇梯度洗脫（25∶1～0∶1），經TLC檢測后合并相同組分得到3個流分（Ⅰ～Ⅲ）。經TLC和HPLC檢測，將流分E和Ⅱ合并得到流分H1（516 g），流分G和流分Ⅲ合并得到H2（300 g）。H1經中壓MDS分離（60%～90%甲醇）得到5個流分（H1O1～H1O5）。其中流分H1O4經HPLC制備分離（36% 乙腈），得到化合物3（7 mg）和化合物4（3 mg）。流分H1O2用HPLC制備分離（76% 甲醇）得到化合物5（6 mg）和化合物6（12 mg）。H2經中壓MDS（40%～70%甲醇）分離得到6個流分（H2O1～H2O6），流分H2O4經HPLC制備分離（31% 乙腈）得到化合物7（50 mg）、化合物8（23 mg）和化合物9（12 mg）。流分H2O2經中壓ODS分離得到6個組分，流分H2O25經HPLC制備分離（27% 乙腈）得到化合物10（7 mg）和化合物11（6 mg），流分H2O22經HPLC制備分離（22%乙腈）得到化合物12（5 mg）。

4化合物的抗病毒實驗

將化合物分別溶解于DMSO中，配制成濃度為002 mol·L-1的儲存液備用。將生長良好的293TGluc細胞以20×105個/mL濃度接種于96孔板中，每孔100 μL 。培養(yǎng)24 h后，每孔加入1 μL待測化合物，同時設置DMSO和Ribavirin分別為陰性和陽性對照組。1 h后利用WSN33感染細胞（MOI=05），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔取10 μL上清，于多功能酶標儀（Berthold Centro LB 960）測定Gluc活性。結果表明在20 μmol·L-1下，化合物2，4，6，8，11～12對流感病毒具有較明顯抑制作用，其抑制率分別為913%， 886%， 534%， 613%， 773%， 574% 。

5討論

柴胡屬植物的主要成分為齊墩果烷型三萜皂苷類成分，其中結構里有13（28）環(huán)氧橋結構的一類是主要的活性成分，包括柴胡皂苷a， d等，該結構對酸和熱不穩(wěn)定。郭智等[9]研究顯示不加堿的條件下，柴胡水提液pH值偏酸性，導致環(huán)氧橋結構被破壞，柴胡皂苷a， d含量大幅減少。所以，加堿是為了防止有環(huán)氧橋結構的皂苷在提取過程中被破壞。含堿溶液提取柴胡皂苷已經成為柴胡皂苷化學研究中普遍應用的方法，Li Z Y、唐智芳、楊瑤君、王鵬、戈宏焱等[1014]在其研究論文中都采取了加堿提取的方法。

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[責任編輯丁廣治]