一株白僵菌菌株的分離鑒定及對(duì)紫薇梨象成蟲致病力的初步研究

張建華　查玉平　陳京元　王義勛　蔡三山　洪承昊　趙東容

摘 要：為了得到用于防控紫薇梨象的高毒力菌株，本試驗(yàn)從野外螢火蟲僵蟲體表分離出一株白僵菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為球孢白僵菌。致病力研究表明，菌株的孢子濃度達(dá)到106個(gè)孢子/ mL時(shí)，對(duì)紫薇梨象的致死率為62.5%，具有成為紫薇梨象成蟲生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：白僵菌；紫薇梨象；真菌殺蟲劑

中圖分類號(hào)： S476.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1004-3020（2016）02-0037-03

Abstract：In order to screen highly pathogenic strains to Pseudorobitis gibbus Redtenbacher， a strain of Beauveria sp. was isolated from dead firefly. The isolate was identified as B. bassiana by morphological characteristics and the method of molecular biology. P. gibbus was sprayed with a suspension of fungal spores with 1× 106 mL， and the corrected mortality of adults was 62.5% after 15 d. It indicated that the strain of B. bassiana can be applied to biological control of P. gibbus in fields.

Key words：Beauveria bassiana； Pseudorobitis gibbus； fungal pesticides

紫薇梨象Pseudorobitis gibbus是一種危害紫薇Lagerstroemia indica的重要害蟲，主要分布于湖北、山東、江蘇、陜西等地[]。紫薇梨象的成蟲和幼蟲均對(duì)紫薇造成危害。其成蟲取食嫩葉、嫩梢、花以及幼嫩種子等，幼蟲則鉆蛀花萼、幼嫩蒴果、種子[2]。目前，對(duì)紫薇梨象有較好防治效果的農(nóng)藥有阿維菌素[3]、吡蟲啉、氰戊菊酯、甲維鹽[]等。

白僵菌是一種對(duì)較多農(nóng)林害蟲具有較好防治成效的真菌殺蟲劑[4]，但是對(duì)紫薇梨象的生物防治研究尚未見報(bào)道。本研究從林間采集的螢火蟲僵蟲上分離純化出一株白僵菌菌株，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。本研究用分離出的菌株對(duì)紫薇梨象進(jìn)行了感染試驗(yàn)，以期獲得紫薇梨象的高效致病菌株，為其生物防治奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株來自蘄春林間采集到的1頭螢火蟲僵蟲。

1.2 菌株分離、純化與鑒定

直接在僵蟲體表挑取菌絲和孢子粉進(jìn)行分離。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1 %吐溫-80的無菌水配制成濃度為1×10個(gè)/mL的孢子懸浮液，然后用接種針分別將孢子懸浮液點(diǎn)植于PDA平板培養(yǎng)基（3 個(gè)培養(yǎng)皿），每皿3 點(diǎn)，成正三角形排列，最后置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第7 d觀察記錄菌落形態(tài)特征。同時(shí)挑取少量菌絲和孢子，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定采用ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 區(qū)域的特異性PCR擴(kuò)增，而后測(cè)序比對(duì)。引物為ITS1F（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）， PCR體系（25 μL）：10× Taq 酶緩沖液，dNTP 各200 mm，MgCl2 3.7 mm，引物各0.4 mm，Taq 酶2 U，模板DNA 5～ 10 ng。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃1 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。DNA測(cè)序由寶生物工程有限公司完成。在GenBank進(jìn)行檢索比對(duì)同源序列。

1.3 感病力測(cè)試

采用噴霧法測(cè)試。野外分離的白僵菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1% 吐溫-80的無菌水配制成濃度為1× 107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，而后再10倍梯度稀釋成 1× 106個(gè)孢子/mL、1× 105個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液。選擇羽化期相同的紫薇梨象成蟲進(jìn)行測(cè)試，將配置好的白僵菌孢子懸浮液分別對(duì)試蟲噴霧處理。每個(gè)處理組10頭，重復(fù)4次。以清水做對(duì)照。處理后置于27±1℃， 60%～80% RH，L∶D= 14∶10的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，及時(shí)補(bǔ)充新鮮無污染的紫薇葉片。第3 d、7 d、15 d觀察試蟲死亡情況。死亡判定：用昆蟲針觸碰蟲體，如無動(dòng)作即為死亡。。

1.4 數(shù)據(jù)調(diào)查與統(tǒng)計(jì)分析

感染后第3 d、7 d、15 d檢查死蟲數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算死亡率，并統(tǒng)計(jì)校正死亡率。

蟲口死亡率（%）= 感染前活蟲數(shù)-感染后活蟲數(shù) 感染前活蟲數(shù) ×100

感染效果（%）= PT-CK 100-CK） ×100

式中： PT—菌液處理后的蟲口死亡率

CK—空白對(duì)照的蟲口死亡率

用DPS2000軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落為白色，絨毛狀，有同心環(huán)，表面平坦無褶皺，有放射溝。在顯微鏡下，分生孢子為光滑無色的球形，確定該菌株屬半知菌亞門Deuteromycotina絲孢綱Hyphomyceres叢梗孢目Moniliales叢梗孢科Moniliaceae白僵菌屬Beauveria。

分離菌株的序列登陸GenBank檢索表明，與該菌株序列同源性最高的菌株為球孢白僵菌，同源性為100 %。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，所分離菌株確定為球孢白僵菌Beauveria bassiana。

2.2 感病力測(cè)定結(jié)果

從表1中可以看出，從螢火蟲僵蟲上分離的菌株對(duì)于紫薇梨象成蟲具有較好的感病效果。在施藥后15 d，1× 106個(gè)孢子/mL和1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液的防效都達(dá)到60 %以上。因此，該菌株具有成為紫薇梨象成蟲專用型生物農(nóng)藥的潛力。

3 討論

紫薇是一種優(yōu)良的庭院觀賞樹和綠化行道樹，具有重要的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。紫薇梨象在2007年首次被發(fā)現(xiàn)對(duì)泰安市紫薇造成嚴(yán)重危害，隨后在湖北、安徽等地相繼有危害紫薇的報(bào)道[3-6]。該蟲危害紫薇的整個(gè)發(fā)育時(shí)期，具有種群數(shù)量大、擴(kuò)散快、危害的時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，大大降低了紫薇的觀賞價(jià)值，并威脅到種實(shí)繁殖[7]。如何有效防治紫薇梨象成為森?？蒲泄ぷ髡叩闹匾n題。

白僵菌是一類寄主范圍廣、持效性良好，與環(huán)境友好，對(duì)人畜無害的生物農(nóng)藥[4]。而且白僵菌的工業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)比較成熟，可以大批量生產(chǎn)用于生物防治。本研究分離的白僵菌菌株對(duì)紫薇梨象成蟲具有較強(qiáng)的感病力，根據(jù)該蟲的生物學(xué)特性，在林間噴灑白僵菌可以有效防治成蟲，為其生物防治提供新途徑。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]李艷，周光鋒，于麗穎，等. 8種藥劑對(duì)紫薇梨象成蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定及室外藥效試驗(yàn)[J]. 中國(guó)森林病蟲，2013，32（4）：30-33.

[2]王菊英，周成剛，喬魯芹，等. 嚴(yán)重危害紫薇的新害蟲——紫薇梨象[J]. 中國(guó)森林病蟲，2010，29（4）：18-20.

[3]查玉平，洪承昊，胡孜進(jìn)，等.阿維菌素對(duì)紫薇梨象的室內(nèi)毒力評(píng)價(jià)[J]. 湖北林業(yè)科技，2010，（6）：30-31.

[4]查玉平，陳京元，夏劍萍. 白僵菌防治森林害蟲的研究與應(yīng)用[J]. 湖北林業(yè)科技，2010，（3）：40-42，39.

[5]靳曉翠，范義榮. 紫薇種質(zhì)資源概況及應(yīng)用現(xiàn)狀分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（1）：16-17，20.

[6]唐長(zhǎng)貞，唐燕平，康克，等. 皖西南紫薇梨象生活史與危害特性研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，39（6）：177-180.

[7] 劉大川，周成剛，李艷，等. 紫薇梨象的危害與紫薇生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2011，33（3）：302-307.

（責(zé)任編輯：鄭京津）