過氧化物酶1對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響

涂青松，何剪太

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長沙410008）

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過氧化物酶1對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響

涂青松，何剪太

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長沙410008）

摘要：目的探討過氧化物酶1（Prx 1）在肝癌形成和惡性進(jìn)展中的作用。方法蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測遠(yuǎn)癌肝組織和近癌肝組織中Prx 1、pAkt及Akt表達(dá)差異。肝細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h后，10 ng/ml表皮生長因子（EGF）處理10 min，提取總蛋白，Western blot檢測Prx 1、pAkt、不同位點(diǎn)磷酸化表皮生長因子受體（EGFR）和總EGFR。Western blot檢測檢測未處理組、轉(zhuǎn)染無義shRNA組及轉(zhuǎn)染Prx 1 shRNA組HepG2細(xì)胞中Prx 1蛋白的表達(dá)。DCFH-DA法檢測3種HepG2細(xì)胞中活性氧簇總量。轉(zhuǎn)染無義shRNA組及轉(zhuǎn)染Prx 1 shRNA組HepG2細(xì)胞皮下注射至SCID小鼠，注射后每周測量1次皮下腫瘤體積。Western blot檢測兩組小鼠皮下腫瘤組織中Prx 1和pAkt的表達(dá)情況。結(jié)果與正常肝細(xì)胞比較，Prx 1在肝轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)升高。Prx 1增強(qiáng)了EGF介導(dǎo)的EGFR和Akt激活。Prx 1表達(dá)沉默抑制了HepG2體內(nèi)成瘤能力。減少HepG2皮下移植瘤的肝轉(zhuǎn)移。Prx 1表達(dá)沉默還抑制了Akt體內(nèi)激活。結(jié)論P(yáng)rx 1具有調(diào)控人肝細(xì)胞中EGFR介導(dǎo)信號通路的潛在作用。Prx 1能夠通過EGFR-Akt信號通路介導(dǎo)細(xì)胞正常至異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成及轉(zhuǎn)移

關(guān)鍵詞：過氧化物酶1；肝癌；移植瘤

全球原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢。盡管不斷有新的肝癌治療手段應(yīng)用于臨床，但是近幾十年來肝癌患者5年期生存率仍未見明顯提高[1]。由于早期肝癌患者的生存率明顯好于晚期肝癌患者，早期檢測腫瘤惡變前損傷是減少肝癌發(fā)病率和致死率的有效方法[1]。因此，研發(fā)新的檢測手段提高肝癌的早期檢出率是肝癌研究十分緊迫的工作。

過氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）是具有過氧化物酶活性的巰基特異性抗氧化蛋白[2]。Prx 6個(gè)家族成員中，Prx1在包括肺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中表達(dá)異常增加[3-4]。本研究主要分析正常肝細(xì)胞和肝癌前病變細(xì)胞中過氧化物酶1（peroxiredoxin 1，Prx 1）的表達(dá)情況，探討Prx1通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/Akt信號通路肝癌前病變細(xì)胞生長增殖情況。此外，本課題還在肝癌移植瘤模型中證實(shí)了Prx 1對腫瘤生長和惡性轉(zhuǎn)化的影響。本研究結(jié)果表明肝癌前病變細(xì)胞中Prx 1表達(dá)增加，Prx 1能夠促進(jìn)肝癌前病變細(xì)胞中表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）表達(dá)，并激活EGFR/Akt信號通路，移植Prx 1表達(dá)能夠抑制肝癌移植瘤模型中腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和EGF處理

在含10%（v/v）小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株L02和CCL13細(xì)胞。所有細(xì)胞在37℃下含5%二氧化碳CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞血清饑餓24 h后，用含10 ng/ml EGF的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 min。立即收獲細(xì)胞并對其進(jìn)行冷凍以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成檢測

使用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）熒光染料分析細(xì)胞提取物中ROS形成速率。DCFH-DA通過與ROS反應(yīng)氧化為二氯熒光素（fluorescent dichlorofluorescein，DCF）。從485 nm激發(fā)波長和530 nm發(fā)射波長上的熒光增加斜率計(jì)算ROS形成速率，使用標(biāo)準(zhǔn)DCF校正。

1.3肝組織活檢

肝組織活檢鉗，檢查肝癌患者血常規(guī)、肝功能、凝血酶原時(shí)間和活動度、B超、心電圖，對患者進(jìn)行屏氣動作訓(xùn)練。B超術(shù)前定位，取右腋中線第8～9肋間或腋前線第9～10肋間隙為穿刺點(diǎn)，于患者深呼氣末屏氣時(shí)采用16號活檢槍，1 s負(fù)壓吸取肝組織，標(biāo)本放入10%甲醛中固定、石蠟包埋，常規(guī)做蘇木精一伊紅（HE）染色、Masson及網(wǎng)狀纖維染色，視臨床病情需要加做免疫組織化學(xué)及特殊染色。術(shù)后予束腹帶包扎4 h，臥床休息8 h，監(jiān)測血壓、脈搏，1周內(nèi)避免劇烈活動。

1.4肝細(xì)胞原代培養(yǎng)

肝組織活檢取下標(biāo)本后，立即置入含青霉素（100 u/ml），鏈霉素（100μg/ml）的無血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，并于1 h內(nèi)處理。組織塊置于培養(yǎng)皿中，加入DMEM液，用眼科剪將不需要的血塊和組織（壞死組織或結(jié)締組織等）除去，再用DMEM液漂洗兩次后剪成約1mm3大小，加入1g/L膠原酶Ⅵ消化液37℃消化30 min，細(xì)胞懸液紗布過濾，1 000 r/min5 min離心2次，棄上清；800 r/min 4 min離心2次，棄上清，每次以DMEM液重懸沉淀。細(xì)胞沉淀重懸于含100 ml/L FBS的DMEM中，測細(xì)胞活力，以>1×109個(gè)/L的濃度接種于25 ml培養(yǎng)瓶，50 ml/L二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。24 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞，加入DMEM液（含10 mg/L胰島素，1 mmol/L谷氨酰胺，100 u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100 ml/L FBS）。37℃50 ml/L二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每兩天半換液，每天倒置顯微鏡觀察，成纖維細(xì)胞通過反復(fù)貼壁分離法、機(jī)械刮除法去除，得到純化的表皮樣生長細(xì)胞，每3天傳代1次。

1.5Prx 1短發(fā)卡RNA表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究構(gòu)建了表達(dá)短發(fā)卡RNA（shRNA）的含人類u6啟動子的自失活逆轉(zhuǎn)錄酶病毒表達(dá)載體。BamHⅡ/HindⅢ雙酶切MSCV表達(dá)質(zhì)粒和pMSCV-EGFP-Neo載體，雙酶切獲得片段鏈接重組，將識別Prx1或錯(cuò)義序列的短發(fā)卡RNA重組至pMSCV-EGFP-Neo載體。Prx1 shRNA能夠識別人類Prx1 cDNA（NM002574）的474-492堿基對。寡核苷酸對的序列為：5'-GATCCGTTCTCACTTCTGTATCT ATTCAAGAGATAGATGACAGAAGTGAGAATTTTT TGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCACT TCTGTCATCTATCTCTTGAATAGATGACAGAATGA GAAC-3'。錯(cuò)義序列為：5'-GATCCCGTTCTCCGAAC GGTGCACGTTTCAAGAGAACGTGCACCGTTCGGA GAATTTTTTGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCCGAACGGTGCACGTTCTCTTGAAACGTGCA CCGTTCGGAGAACGG-3'。采用ABI 3700毛細(xì)管測序儀（Applied Biosystems）確認(rèn)序列準(zhǔn)確性。

1.6構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株

使用Lipofectamine 2000試劑將Prx 1或錯(cuò)義shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至Phoenix包裝細(xì)胞。48 h后，收集上清液，0.45μm濾膜過濾，并于-80℃冰箱保存。將過濾后的Prx 1或錯(cuò)義shRNA病毒上清液與4μg/ml凝聚胺（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑）分別共同感染HepG2細(xì)胞。連續(xù)2 d每8 h將新鮮的病毒上清液加入到細(xì)胞中。含有2μg/ml嘌呤霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，選取感染成功細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7蛋白質(zhì)印跡分析（Western blot）

棄去培養(yǎng)皿中DMEM培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）輕柔洗滌去除雜質(zhì)，按每皿50 L加入含2%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰上裂解5 min，收集裂解產(chǎn)物超聲破碎10 min后4℃12 000 rpm離心30 min。收集上清蛋白液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法對蛋白含量定量后備用。定量過的樣品按每泳道30 g蛋白含量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗（兔抗小鼠Prx 1，1∶2000；β-actin，l∶1 000；兔抗小鼠p-Akt，1∶500），4℃過夜。山羊抗兔二抗（1∶20 000）室溫下1 h，化學(xué)法發(fā)光，壓片后分析結(jié)果。最后用SPSS 18.0圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值。

1.8體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)及肝轉(zhuǎn)移瘤確定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為106/ml，將500μl細(xì)胞懸液注射至非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠背部皮下。8周后引頸處死，分離腫瘤組織，并測量腫瘤組織體積，腫瘤組織制作成冷凍切片用于免疫熒光分析。使用游標(biāo)卡尺每周2次測量分析腫瘤生長情況，腫瘤體積由公式（長度×寬度2）/2估算。

注射腫瘤細(xì)胞后8周后將小鼠處死。將每只小鼠的肝臟從周圍組織中剖離，之后將肝臟橫切。通過氣管注射墨汁直至肝臟染黑。隨后將肝臟切開，隨后將標(biāo)本放置在Fekete溶液中24 h漂白肝臟表明腫瘤結(jié)節(jié)。對比染色形成白色肝臟轉(zhuǎn)移瘤和黑色正常肝臟組織之間的明確區(qū)分。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式（±s）表示，進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、樣本的正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD-t檢驗(yàn)（多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用）。除方差齊性檢驗(yàn)時(shí)取P<0.10認(rèn)為檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均取P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1異常肝細(xì)胞中Prx 1和pAkt上調(diào)

本實(shí)驗(yàn)通過獲取配對肝細(xì)胞，并檢測配對肝細(xì)胞中Prx 1蛋白表達(dá)差異情況，探討癌前肝細(xì)胞中Prx 1的表達(dá)情況。原代肝細(xì)胞從肝癌組織、近癌肝組織和遠(yuǎn)癌肝組織中分離培養(yǎng)。與正常肝細(xì)胞比較，異常（癌前病變，源自近癌肝組織）肝細(xì)胞Prx 1表達(dá)上調(diào)（見表1、圖1）。正常細(xì)胞到異常細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化與Akt等細(xì)胞內(nèi)信號分子變化有關(guān)，采用Pearson直線相關(guān)分析pAkt水平與Prx 1蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)系，用相關(guān)系數(shù)r表示，結(jié)果顯示：Akt水平與Prx 1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.863，P<0.01），提示pAkt水平上升與Prx1蛋白表達(dá)水平緊密相關(guān)。

提取遠(yuǎn)癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織（惡性轉(zhuǎn)化肝組織）蛋白，Western blot檢測Prx 1、pAkt、Akt及β-actin在兩組肝組織中的表達(dá)差異。

表1　遠(yuǎn)癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織中Prx 1、pAkt、Akt相對表達(dá)情況（n=4，±s）

表1　遠(yuǎn)癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織中Prx 1、pAkt、Akt相對表達(dá)情況（n=4，±s）

注：?兩組間蛋白相對表達(dá)值比較采用t檢驗(yàn)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

組別　Prx 1/β-actin　pAkt/β-actin　Akt/β-actin遠(yuǎn)癌肝組織組　0.473±0.142　0.366±0.125　0.836±0.142近癌肝組織組　0.894±0.264?　0.748±0.214?　0.722±0.137 t值　7.182　6.483　0.182 P值　0.027　0.032　0.725

圖1　Prx 1在肝細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2Prx 1增強(qiáng)EGF介導(dǎo)的EGFR與Akt激活

與空白對照組肝細(xì)胞株L02比較，癌前病變肝細(xì)胞（CCL13）中Prx 1蛋白表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =5.738，P=0.037）?；€狀態(tài)時(shí)，L02或CCL13細(xì)胞中均未檢測到Akt激活（見圖2A）。與Prx 1低水平表達(dá)的L02細(xì)胞比較，Prx 1表達(dá)較高的CCL13細(xì)胞中EGF介導(dǎo)的Akt激活明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =8.412，P=0.001）（見圖2B）。5種關(guān)鍵性EGFR磷酸化殘基中，只有酪氨酸1173殘基對EGF處理有反應(yīng)；這種殘基被稱為導(dǎo)致Akt激活的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果提示原代肝細(xì)胞中，Prx 1水平較高增加了Akt信號，Prx 1可能與EGF介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。

2.3Prx 1表達(dá)敲除對腫瘤生長和體內(nèi)新陳代謝的影響

Western blot檢測表明，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)靶向Prx 1的短發(fā)卡RNA（shPrx-1）HepG2細(xì)胞中Prx 1表達(dá)明顯受到抑制，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.341，P=0.000）（見圖3A），證實(shí)shPrx 1轉(zhuǎn)染成功，但是轉(zhuǎn)染shPrx 1對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生無影響，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.124，P=0.892）（見圖3B）。Prx 1表達(dá)敲除后顯著地抑制了腫瘤生長，第24天開始，shPrx 1組腫瘤體積均明顯比無義shRNA轉(zhuǎn)染組?。ň鵓<0.05）（見圖4）。第56天時(shí)，在SCID鼠體中皮下注射每種細(xì)胞3×106個(gè)，并檢查肝轉(zhuǎn)移瘤確定遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移特性。如圖5所示，敲除Prx 1降低了HepG2移植瘤中肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)病率，shPrx 1組肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量明顯少于無義shRNA轉(zhuǎn)染組（t=6.132，P=0.035）。

圖2　Prx 1對EGF誘導(dǎo)的EGFR-Akt信號通路激活的影響

此外，磷酸化Akt程度與Prx 1蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)，Pearson直線相關(guān)分析血清磷酸化Akt程度與Prx 1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.954，P<0.01）（見圖6）。腫瘤中Prx 1表達(dá)敲除后的作用持續(xù)至首次注射肝癌細(xì)胞56d后，Prx 1表達(dá)敲除肝腫瘤pAkt表達(dá)水平較低，該結(jié)果表明，Prx 1在調(diào)節(jié)人類肝癌Akt激活中起主要作用。

圖3　Prx 1表達(dá)下調(diào)使肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平下降

圖4　Prx 1表達(dá)沉默抑制了HepG2細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力

圖5　Prx 1表達(dá)沉默抑制了HepG2移植瘤轉(zhuǎn)移至肝臟的能力

圖6　Prx 1表達(dá)沉默抑制體內(nèi)Akt激活

3　討論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌前病變肝細(xì)胞中Prx 1表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞，在惡性肝癌組織中Prx 1表達(dá)水平也顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞向異常細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的Prx 1表達(dá)升高與Akt激活增加有關(guān)。采用shRNA抑制肝癌細(xì)胞中Prx 1表達(dá)后，肝癌細(xì)胞移植瘤模型中腫瘤生長和轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，提示Prx 1可能與腫瘤進(jìn)展和侵襲有關(guān)，而Akt激活降低與腫瘤發(fā)生減少顯著相關(guān)。

以往研究認(rèn)為Prx 1能夠增強(qiáng)細(xì)胞生存能力，是因?yàn)镻rx1具有抗氧化劑作用[5]。Prx1在N端（Cys52）含有具有催化作用的半胱氨酸，該半胱氨酸能夠通過巰基氧化（Cys52-SOH，次磺酸）降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。Cys52-SOH在C-端，Cys173能夠通過保守解離的半胱氨酸形成一種分子間的雙硫鍵，該雙硫鍵通過硫氧還蛋白（Trx）/硫氧化還原蛋白還原酶（TR）等體系的電子供體還原為活性巰基形式，Cys52-SH[6-7]。體內(nèi)外研究均表明抑制Prx 1表達(dá)能夠增強(qiáng)腸癌肺癌放射治療敏感行。這些研究均證實(shí)以下這一觀點(diǎn)：Prx 1是抗氧化蛋白，因?yàn)橐种芇rx 1表達(dá)引起放射敏感性增強(qiáng)是由于ROS產(chǎn)量升高。盡管以往體內(nèi)外研究都發(fā)現(xiàn)抑制Prx 1表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)POS產(chǎn)生，但是本研究中Prx 1表達(dá)下調(diào)肝癌細(xì)胞中ROS并未顯著增加，本研究結(jié)果與Kim等[8]研究結(jié)果一致，Kim等發(fā)現(xiàn)放療后，Prx 1過表達(dá)在抑制了c-Jun N-端激酶激活（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和凋亡性細(xì)胞死亡。然而，Prx 1的抗氧化活性功能對于該過程并不是必需的，因?yàn)橐吧蚉rx 1和缺少抗氧化活性的突變Prx 1（Prx-1C52S）都能通過與GSTpi-JNK復(fù)合物結(jié)合高效阻斷JNK激活和細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果還表明Prx 1具有調(diào)控人肝細(xì)胞中EGFR介導(dǎo)信號通路的潛在作用。Prx 1高表達(dá)細(xì)胞中配體誘導(dǎo)EGFR Tyr1173殘基磷酸化增強(qiáng)，從而導(dǎo)致Akt激活。Prx 1增強(qiáng)EGFR信號功能的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近期研究表明，Prx 1具有分子伴侶的功能，且這一功能不依賴于Prx 1的過氧化物酶活性[9]。作為伴侶蛋白，Prx 1改變了各種細(xì)胞蛋白的功能和活性，包括c-Abl酪氨酸激酶、巨噬細(xì)胞移動抑制因子、c-Myc致癌基因、雄激素受體等。Prx 1具有多種生理功能的重要原因就是Prx 1能夠與生長調(diào)節(jié)蛋白相互作用。近期蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示Prx 1能夠與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Ezrin相互作用。Ezrin是一種磷蛋白，能夠增強(qiáng)生長因子誘導(dǎo)磷酸化，并將PI3K/Akt等信號通過蛋白間直接相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游。Ezrin是論證Prx 1增強(qiáng)EGFR-Akt生存信號通路功能的理想靶點(diǎn)。

本文研究結(jié)果進(jìn)一步揭示Prx 1能夠通過EGFR-Akt信號通路介導(dǎo)細(xì)胞正常至異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成、轉(zhuǎn)移，提示Prx 1可能是肝癌早期檢測重要靶點(diǎn)。目前有許多研究致力于基于靶點(diǎn)策略進(jìn)行腫瘤早期檢測，但是這些靶點(diǎn)都專注于個(gè)別靶分子。隨著Prx 1研究的深入，與Prx 1相互作用的靶分子/效應(yīng)分子的范圍可能進(jìn)一步擴(kuò)展。盡管這些相互作用的功能結(jié)果需要以細(xì)胞類型和組織環(huán)境限制模式進(jìn)行檢測和闡述，但抑制Prx 1表達(dá)能夠同時(shí)作用多個(gè)靶點(diǎn)蛋白干預(yù)肝細(xì)胞癌形成。

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（張蕾編輯）

論著

Effect of Prx-1 on growth of hepatocellular carcinoma xenografts

Qing-song Tu, Jian-tai He (Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

Abstract:Objectives To investigate the role of Prx 1 in hepatocellular carcinoma. Methods The expression of Prx-1, pAkt and Akt in distal hepatocellular carcinoma and para- carcinoma tissue was detected by Western blot. Human liver cells were treated with 10 ng/ml EGF for 10 min after 24 hrs after serum starvation. Total proteins were extracted immediately after 10-min EGF treatment and used for Western blot. Equal amount of protein (20 μg) was separated by SDS-PAGE and probed with antibodies specific to Prx 1, pAkt, various phosphorylated forms of EGFR and total EGFR. Prx 1 protein levels in parental (untransfected), scramble, and Prx-1shRNA transfected HepG2 cells were measured by Western blot. Reactive oxygen species (ROS) levels determined from HepG2 sublines by using probe DCFH-DA. HepG2/Prx 1Sc and HepG2/Prx-1KD cells were injected into the dorsal flank of male SCID mice. Tumor size was measured every week after injection. Protein extracted from HepG2/Prx 1Sc and HepG2/Prx 1KD tumor tissues was subjected to Western blot analysis. Equal amount of protein (20 μg) was separated by SDS-PAGE and probed with antibodies specific to Prx-1and pAkt. Results Increased expression of Prx 1 was observed in abnormal (pre-malignant) liver cells compared to their paired normal liver cells. Prx 1 enhances EGF-mediated EGFR and Akt activation. Prx-1 knock-down inhibits tumor growth of HepG2 xenografts in vivo. Prx 1 knock-down reduces liver metastasis of HepG2 xenografts in vivo. Prx-1 knock-down inhibits Akt activation in vivo. Conclusions A potential role for Prx-1 in regulation of EGFR mediated signaling pathways in human liver cells. Prx-1 in mediates normal-to-abnormal cell transition, tumorigenesis, and metastasis through EGFR-Akt signaling pathways.

Keywords:peroxiredoxin-1; hepatocellular carcinoma; xenografts

收稿日期：2015-11-18

文章編號：1005-8982（2016）08-0011-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.003

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A